不同貯藏溫度下甲魚肌肉品質和ATP 關聯產物變化研究

孫欽軍,包建強,2,3*,徐志善,王錫念,馬翼飛

(1 上海海洋大學食品學院,上海201306;2 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海201306;3農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海201306)

甲魚,學名鱉(Trionyx sinensis),俗稱團魚、腳魚等,隸屬于鱉科(Trionychidae)鱉屬(Trionyx)[1],在中國大部分地區均有分布。 甲魚具有較高的食藥價值,蛋白質含量豐富、酶類生物活性較強,死后極易發生腐敗變質。

目前,水產品常用保鮮方法有低溫保鮮、真空保鮮、氣調保鮮、化學與輻射保鮮等,其中低溫保鮮以良好的保鮮效果受到眾多學者的關注[2-3]。 李越華等[4]研究表明,在-3 ℃條件下,鯽魚貨架期較4 ℃延長16 d,微凍貯藏具有更好的保鮮效果,能明顯延長鯽魚貨架期。 王立娜等[5]研究表明, -2 ℃貯藏的鯉魚肉在感官品質、色澤與揮發性成分的變化上優于4 ℃冷藏。 Alasalvar 等[6]研究表明,第12 天時,4 ℃冷藏條件下與-3 ℃微凍條件下養殖鯛魚和野生鯛魚的肌苷酸(IMP)含量相比第0 天分別下降98.8%和81.3%,4 ℃冷藏條件下IMP 含量的下降速率顯著大于-3 ℃微凍貯藏的速率。 目前,國內外主要對甲魚的生活環境、營養價值、藥用價值及基因等[7-9]方面進行研究,而對低溫貯藏過程中甲魚品質變化的研究未見相關報道。

本試驗以甲魚作為研究對象,依據家庭貯藏習慣,選取冷藏室溫度(4 ℃、0 ℃)與微凍室溫度( -3 ℃)為貯藏條件,測定甲魚肌肉菌落總數、pH、硫代巴比妥酸值(TBARS)、揮發性鹽基氮(TVB-N)、ATP 關聯產物、K 值和感官品質等指標,研究不同貯藏溫度下甲魚肌肉品質的變化規律,以期為甲魚低溫保鮮與加工研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮甲魚購于浙江省寧波市明鳳漁業有限公司,甲魚質量(750 ±50)g∕只,均為同齡甲魚,活體運至實驗室。

DSC-Q2000 型差示掃描量熱儀(美國TA 儀器公司),LRH-100CA 型、DHP-9162 型恒溫恒濕培養箱(上海一恒科學儀器有限公司),H1850R 型臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司),YXQ-LS-30SH 型全自動壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司),Waters-e2695 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司),S2 型pH 計(梅特勒-托利多儀器有限公司),UV-757 型紫外分光光度計(杭州科曉儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

甲魚宰殺后,無菌水洗凈、瀝干,將處理干凈的甲魚肌肉裝入PE 保鮮袋中,排出空氣,分裝,置于4 ℃、0 ℃、-3 ℃的恒溫恒濕箱內貯藏。 4 ℃、0 ℃處理每2 d 測定一次指標,-3 ℃處理每3 d 測定一次指標,各指標均重復測定3 次。

1.2.2 冰點測定

參考劉大松[10]測定冰點的方法,采用差示掃描量熱法(Differential scanning calorimetry,DSC)測定甲魚冰點。 準確稱取甲魚肌肉5—12 mg,加入已知質量的鋁坩堝,選取相同質量的鋁坩堝作為空白對照,鋁坩堝壓封,上機測定。 設置程序:初溫為10 ℃,以50 ℃∕min 降溫至-40 ℃,恒溫5 min,以5 ℃∕min 升溫至5 ℃。 降溫曲線的峰起始溫度為凍結溫度,升溫曲線的峰值相變溫度為熔融點溫度,即為甲魚冰點溫度[11]。

1.2.3 菌落總數測定

采用GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》的方法測定甲魚肌肉的菌落數量。

1.2.4 pH 測定

用剪刀剪碎甲魚肌肉并混合均勻,準確稱取5.00 g 肉樣,加入45 mL 去離子水(煮沸后冷卻至室溫),均質后靜置30 min,測定pH 并記錄。

1.2.5 硫代巴比妥酸值(TBARS)測定

參考Siu 等[12]方法測定。

1.2.6 揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定

測定方法參照GB∕T 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》。

1.2.7 ATP 關聯產物與K 值測定

參照Yokoyama 等[13]的方法測定ATP 關聯產物。 精確稱取甲魚肌肉5.000 g,剪碎待用,加入10 mL預冷的10%高氯酸,均質機勻漿后,4 ℃下10 000 r∕min 離心10 min,取上清液,用10 mL 預冷的5%高氯酸洗滌沉淀,離心,合并上清液。 用氫氧化鈉溶液調節pH 至6.5,轉至50 mL 容量瓶定容,搖勻后0.45 μm膜過濾,上機HPLC 分析,外標法定量。

K值是ATP 的分解產物次黃嘌呤核苷(HxR)與次黃嘌呤(Hx)總量占ATP 關聯物總量的百分比,通過ATP 關聯物含量的變化可計算出K值[14]。K值低于20%被認為是一級鮮度,20%—60%為二級鮮度,60%—80%則處于初期腐敗狀態[15],K值超過60%就表示該樣品無法食用。

式中:ATP(腺苷三磷酸)、ADP(腺苷二磷酸)、AMP(腺苷酸)、IMP(肌苷酸)、HxR、Hx 均為樣品中的含量,單位為μmol∕g。

1.2.8 感官測定

參考GB∕T 29605—2013《感官分析 食品感官質量控制導則》并結合甲魚實際特點制定感官評價表(表1)。 以表1 中指標為評分標準,由10 名感官評定人員對貯藏期內的甲魚肌肉進行評分,感官評定結果取平均值,平均分16 分以上為一級鮮度,10—16 分為二級鮮度,低于10 分為不可接受。

表1 甲魚肌肉感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of soft-shelled turtle muscle

1.3 數據處理

采用Excel 2016 和SPSS Statistics 22.0 軟件進行數據分析與差異性顯著分析,P＜0.05 表示具有顯著性差異;利用Origin 9.1 軟件制圖,數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 冰點測定

圖1 為甲魚肌肉熔融DSC 曲線,熱流為負值,表示處于吸熱過程,溫度在未進入冰溫帶之前,熱流平穩,所需能量未出現顯著變化;甲魚肌肉進入冰溫帶,熱流變化顯著,所需能量增加,在-1.43 ℃達到最大值,因此判定甲魚冰點溫度為-1.43 ℃。 根據微凍定義,微凍貯藏溫度一般低于冰點溫度1—2 ℃,結合家庭冰箱微凍室溫度,選取-3 ℃為甲魚微凍貯藏溫度。

2.2 不同貯藏溫度下甲魚肌肉菌落總數的變化

如圖2 所示,不同貯藏溫度下甲魚肌肉菌落總數均不斷增加,4 ℃貯藏甲魚肌肉菌落總數增長速率顯著高于0 ℃和-3 ℃貯藏,貯藏8 d 后菌落總數顯著超出限量標準[6.0lg(CFU∕g)][16]。 0 ℃和-3 ℃條件下甲魚肌肉菌落總數分別在貯藏前6 d、15 d 增長相對緩慢,隨后菌落總數增長速度加快,并分別于15 d、27 d 超出限量標準。 如以菌落總數為參考依據,4 ℃、0 ℃和-3 ℃貯藏條件下甲魚肌肉貨架期分別為6 d、13 d 和26 d,-3 ℃貯藏時間較4 ℃和0 ℃貯藏分別延長了7 d、13 d,-3 ℃貯藏可以有效降低甲魚肌肉微生物生長繁殖的速度,延緩甲魚肌肉品質劣變。

2.3 不同貯藏溫度下甲魚肌肉pH 的變化

如圖3 所示,貯藏期間甲魚肌肉pH 呈先降后升的“V”型趨勢,不同貯藏溫度下甲魚肌肉pH 變化均在6.79—7.00,4 ℃、0 ℃和-3 ℃條件下甲魚肌肉分別在2 d、4 d、9 d 降至最小值,隨后呈上升趨勢。4 ℃、0 ℃和-3 ℃貯藏條件下甲魚肌肉pH 分別于8 d、14 d 和27 d 升至7.01、6.97、6.98,-3 ℃貯藏條件下甲魚肌肉pH 增加速度顯著低于4 ℃和0 ℃貯藏。

2.4 不同貯藏溫度下甲魚肌肉TBARS 值的變化

如圖4 所示,新鮮甲魚TBARS 值為0.145 mg MDA∕kg,隨著貯藏時間的延長,不同貯藏溫度下甲魚肌肉TBARS 值均呈上升趨勢,4 ℃貯藏甲魚肌肉脂肪氧化酸敗變化速度顯著高于0 ℃與-3 ℃貯藏。4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下TBARS 值在8 d、14 d、27 d 分別升至0.512 mg MDA∕kg、0.468 mg MDA∕kg、0.496 mg MDA∕kg,-3 ℃貯藏在延緩甲魚肌肉脂肪氧化酸敗方面具有明顯的優勢。

2.5 不同貯藏溫度下甲魚肌肉TVB-N 值的變化

依據國標GB 2733—2015《食品安全國家標 準鮮、凍動物性水產品》規定,淡水魚蝦類揮發性鹽基氮含量不得超過國家二級鮮度標準[20 mg∕(100 g)]。 如圖5 所示,不同貯藏溫度下甲魚肌肉揮發性鹽基氮含量均呈不斷上升的變化趨勢,4 ℃、0 ℃條件下甲魚肌肉TVB-N 值增加速度顯著高于-3 ℃貯藏,4 ℃、0 ℃分別貯藏8 d、16 d 超出國家二級鮮度標準,-3 ℃貯藏27 d 才超出國家二級鮮度標準,-3 ℃貯藏減緩了低級胺類化合物生成速度,延長了甲魚肌肉貯藏時間。 如以TVB-N 值為依據,4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉的貨架期分別為6 d、15 d、26 d。

2.6 不同貯藏溫度下甲魚肌肉ATP 關聯產物與K 值的變化

由圖6A 可知,不同貯藏溫度下甲魚肌肉ATP 值均呈下降趨勢(P＜0.05),貯藏前期,4 ℃、0 ℃、-3 ℃處理甲魚肌肉ATP 含量分別在2 d、4 d 、6 d 下降超過90%,之后各處理ATP 含量均處于較低水平且趨于穩定。

如圖6B 所示,不同貯藏溫度下甲魚肌肉IMP 含量均呈現先上升后下降變化趨勢,4 ℃和0 ℃在貯藏2 d 時達到峰值(1.18 μmol∕g 、1.88 μmol∕g),-3 ℃處理在第3 天達到峰值(2.09 μmol∕g),隨后IMP 含量均呈下降趨勢。 貯藏結束時,IMP 含量分別為0.018 μmol∕g(4 ℃,8 d)、0.027 μmol∕g(0 ℃,14 d)、0.013 μmol∕g( -3 ℃,27 d)。 與4 ℃和0 ℃貯藏相比, -3 ℃貯藏能有效降低甲魚肌肉IMP 分解速率,延長肌肉鮮味保持時間。

甲魚肌肉HxR 含量整體呈先上升后下降變化趨勢(圖6C),4 ℃、0 ℃和-3 ℃貯藏溫度下分別于4 d、6 d 與12 d 升至最大值,之后HxR 含量分別于8 d、14 d、27 d 降至0.375 μmol∕g、0.243 μmol∕g 和0.225 μmol∕g。

如圖6D 所示,4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉Hx 含量均隨時間延長不斷增加,貯藏末期Hx 含量分別增至0.435 μmol∕g(8 d)、0.432 μmol∕g(14 d)、0.441 μmol∕g(27 d)。 隨著Hx 含量不斷增加,甲魚肌肉也逐漸趨于腐敗。

由圖7 可以看出,不同貯藏條件下甲魚肌肉K 值均呈上升趨勢,0 ℃和-3 ℃貯藏條件下K 值變化速度顯著低于4 ℃貯藏。 4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉K 值分別于3 d、5 d、9 d 超過國家一級鮮度標準,于8 d、14 d和27 d 超過國家二級鮮度標準。 以K 值為依據,4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉貨架期分別為7 d、13 d、26 d。

2.7 不同貯藏溫度下甲魚肌肉感官品質的變化

如圖8 所示,不同貯藏溫度下甲魚肌肉感官品質均隨貯藏時間的延長而下降,溫度越低,下降速度越慢。 貯藏過程中4 ℃、0 ℃、-3 ℃處理甲魚肌肉分別在3 d、5 d、9 d 進入國家二級鮮度范圍,此結果與K值測定結果一致,之后3 組分別于8 d、14 d、27 d 超出可接受范圍,甲魚肉色澤暗淡,原有氣味消失,粘液較多。 通過感官品質評定發現,-3 ℃貯藏條件下甲魚肌肉在感官品質方面具有明顯的優勢,甲魚感官品質變化速度相對較慢。 以感官品質為依據,4 ℃、0 ℃、 -3 ℃貯藏條件下甲魚肌肉貨架期分別為7 d、13 d、25 d。

3 討論與結論

甲魚肌肉腐敗變質原因主要有兩個:一是外界微生物的污染,二是肌肉自身酶的活動[17]。 微生物生長繁殖與酶的活性均受溫度的影響。 4 ℃不足以抑制微生物與酶的活性,甲魚肌肉蛋白質在水解酶的作用下分解為氨基酸及揮發性氨、三甲胺和二甲胺等低級胺類化合物[18],促使TVB-N 含量顯著上升,同時細菌利用氨基酸等大量繁殖并產生氨、吲哚、硫化氫、組胺等有腐臭味的物質[19],造成甲魚肌肉鮮度下降。0 ℃和-3 ℃處于甲魚肌肉冰溫帶,大部分微生物與酶的活性被抑制,同時細菌體液中水分部分凍結,體積增大產生擠壓,使菌體破裂死亡[20],其菌落總數分別在6 d、15 d 前增長緩慢,隨著貯藏時間的延長,肌肉體表與體內的微生物逐漸適應環境大量繁殖,TVB-N 含量增加,甲魚肌肉鮮度下降,品質劣變速度增快。 對菌落總數與TVB-N 值、K 值進行相關性分析發現,4 ℃、0 ℃、 -3 ℃條件下甲魚肌肉菌落總數與TVB-N 值相關系數為0.997、0.944、0.944,與K 值相關系數為0.989、0.959、0.891,表明TVB-N 值、K 值變化與菌落總數變化具有高度一致性,微生物是影響甲魚肌肉品質劣變的重要因素。

貯藏過程中脂質氧化會導致風味劣變、營養損失,甚至會產生毒素,嚴重影響甲魚肌肉品質[21]。 本試驗發現,低溫有效延緩了不飽和脂肪酸氧化酸敗,-3 ℃貯藏TBARS 值增長速度顯著低于4 ℃和0 ℃貯藏。 TBARS 值以丙二醛(MDA)含量反映脂肪氧化酸敗程度,當TBARS 值超過1.0—2.0 mg MDA∕kg 時肌肉會產生不良氣味[22],4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下貯藏8 d、14 d、27 d 甲魚肌肉已無法食用,但其TBARS 值仍未超過閾值,其原因可能是MDA 與胺類、核酸、蛋白質、磷脂氨基酸以及脂肪氧化的終產物醛類物質發生反應[22],因此在判斷甲魚肌肉貨架期時,TBARS 值不宜單獨作為參考指標。

甲魚宰殺后肌細胞中肌漿網的鈣離子吸附能力下降,大量鈣離子進入細胞液中,細胞液中鈣離子濃度升高激活了肌原纖維ATP 酶的活性,ATP 被快速降解[23],同時肌肉也因ATP 分解產生的磷酸和無氧條件下糖原酵解產生的乳酸導致pH 下降,隨著貯藏時間延長,甲魚肌肉糖原酵解逐漸停止,ATP 降至較低水平,pH 出現最小值,隨后微生物分解蛋白質產生的堿性物質逐漸增多,肌肉pH 逐漸升高。 4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉IMP 含量貯藏期間均出現蓄積過程,之后在磷酸單酯酶和核苷水解酶作用下進一步分解產生HxR 和Hx[24],貯藏6 d, -3 ℃條件下IMP 含量為1.718 μmol∕g,4 ℃和0 ℃僅分別為0.762 μmol∕g 、0.257 μmol∕g,溫度越低,IMP 分解速度越慢。 IMP 作為ATP 降解的中間產物,是鮮味的主要來源[25],降低溫度有利于維持甲魚肌肉鮮味,保持肌肉品質。 不同貯藏溫度下甲魚肌肉HxR 含量呈先升后降的變化趨勢,貯藏前期HxR 生成速度顯著大于降解速度,隨著貯藏時間延長,核苷磷酸化酶降解HxR 速度逐漸增快,大量HxR 脫去1-磷酸核糖生成Hx[26],Hx 作為肉中苦味物質不斷積累造成甲魚肌肉新鮮度下降[27]。

水產品理化性質、微生物相關指標通常會與感官評價相結合[28]。 本試驗中,4 ℃、0 ℃、-3 ℃條件下甲魚肌肉感官評價分別于8 d、14 d、27 d 超出可接受范圍,這與菌落總數、TVB-N 值和K 值所得結論相吻合。

本試驗通過研究不同貯藏溫度下甲魚肌肉品質和ATP 關聯產物變化發現,降低溫度有助于延緩甲魚肌肉品質劣變,延長甲魚貯藏時間。 綜合研究得知,家庭選取微凍貯藏(-3 ℃)更有利于維持甲魚肌肉鮮度,保持甲魚品質,4 ℃、0 ℃、-3 ℃貯藏貨架期分別為6 d、13 d、25 d。