礬根葉柄和葉片不定芽高效再生體系優化

孫 翊,殷麗青,張永春*,庹曉慶,付正龍,田 莉,3

(1 上海市農業科學院林木果樹研究所,上海201403;2 上海安康園藝工程有限公司,上海201111;3長江大學園藝園林學院,荊州434025)

礬根(Heucheraspp.)是虎耳草科礬根屬(Heuchera)植物的統稱,原產于美洲中部,為宿根花卉類群。其花葉兼美,葉色亮麗且顏色豐富,是不可多得的新優彩葉地被觀賞植物,可作為邊飾、叢植、地被、盆栽等材料應用[1],也可用于土壤修復[2],在我國花卉市場上關注度不斷上升。 目前,大部分礬根品種以無性繁殖方式進行種苗生產[3]。 分株繁殖和扦插繁殖周期長、繁殖系數低、受季節影響大[4]。 組織培養技術是現今規模化繁育礬根種苗的主要方法。 礬根的組培快繁技術絕大部分以芽作為起始擴繁的材料[5-8],存在取材困難、數量較少、對母株破壞性大等問題。 已有的研究顯示,礬根葉柄和葉片經誘導均可獲得愈傷組織,然而兩者的誘導率不高,分別為19%和11%[9]。 利用礬根葉柄作為起始擴繁材料建立礬根離體再生體系,不定芽分化率較高,達81.25%[10],然而該方法需經過愈傷組織階段,且期間需要更換培養基,操作較為復雜。

植物高效再生體系的建立是成功進行基因轉化的基礎,能夠為深入開展植物遺傳機理研究和品質改良提供重要支撐[11]。 本研究以礬根無菌苗的葉柄和葉片作為外植體,通過對培養條件和植物生長調節劑濃度進行篩選,直接誘導并分化獲得不定芽,旨在建立一種更為簡便、經濟且有效的礬根直接再生體系,為礬根種苗的快速繁殖及新品種的培育奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以礬根‘巴黎’和‘閃秋’無菌苗的葉柄和葉片為外植體,將葉柄剪成0.8—1 cm 長,葉片剪成約0.5 cm×0.5 cm,用于后續接種。

1.2 試驗方法

將外植體接種于培養基上進行誘導,每皿接種12 個外植體。 培養基成分:以MS 為基本培養基,均添加3%蔗糖、0.6%瓊脂粉、0.1 mg∕L 萘乙酸(Naphthylacetic acid,NAA),并分別添加不同濃度的噻重氮苯基脲(Thidiazuron,TDZ)和6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)。 所有培養基pH 均為5.8,并經121 ℃、0.11 MPa 的高溫、高壓滅菌20 min。 培養室溫度為(24 ±2) ℃,先進行暗培養,再轉移至光照強度為(35 ±3)μmol∕(m2·s),光照12 h∕黑暗12 h 條件下培養。

1.2.1 暗培養時間的篩選

將外植體接種于MS+0.2 mg∕L TDZ+0.1 mg∕L NAA 培養基上進行培養,暗培養時間設置0 d、7 d、14 d、21 d 和28 d 共5 個處理,之后進行光照培養,每個處理重復4 次,接種50 d 后統計不定芽再生率和不定芽數。 不定芽再生率=分化獲得有效不定芽的外植體數∕接種的外植體數×100%;不定芽數為每皿12 個外植體總計分化獲得的有效不定芽數量。

1.2.2 植物生長調節劑種類和濃度的篩選

以MS +0.1 mg∕L NAA 為基礎,分別添加不同質量濃度的TDZ(0.1 mg∕L、0.2 mg∕L、0.5 mg∕L、1.0 mg∕L)或者6-BA(0.2 mg∕L、0.5 mg∕L、1.0 mg∕L、2.0 mg∕L)配制培養基,將外植體接種于其上進行培養,暗培養時間為21 d,之后進行光照培養,每個處理重復4 次,30 d 后統計不定芽再生率和不定芽數。

1.3 數據統計

分析采用SPSS 17.0 軟件進行方差分析(ANOVA)和多重比較分析(Duncan),顯著水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 不同暗培養時間對礬根葉柄和葉片不定芽再生的影響

在不同的暗培養時間條件下,礬根‘巴黎’和‘閃秋’的葉片和葉柄均能夠產生不定芽,不定芽再生率和不定芽數在處理間具有明顯差異(表1 和表2)。 隨著暗培養時間的增加,礬根不定芽再生率和不定芽數均呈現出先升高再下降的趨勢,均在暗培養21 d 時達到峰值。 而品種間具有一定的差異性,‘巴黎’的再生情況優于‘閃秋’,表現為前者的不定芽再生率和不定芽數總體高于后者。 此外,在不同外植體材料間,‘巴黎’葉柄的再生情況優于葉片,而‘閃秋’葉片的再生情況優于葉柄。 ‘巴黎’的不定芽再生率最高為56.25%,‘閃秋’為45.83%;‘巴黎’的不定芽數最高為9.75 個,‘閃秋’為7.75 個。

表1 不同暗培養時間對礬根葉片不定芽再生的影響Table 1 Effects of different periods of darkness culture on the adventitious shoot regeneration from leaf blades of Heuchera spp.

表2 不同暗培養時間對礬根葉柄不定芽再生的影響Table 2 Effects of different periods of darkness culture on the adventitious shoot regeneration from petioles of H. spp.

2.2 植物生長調節劑種類和濃度對礬根葉柄和葉片不定芽再生的影響

以礬根‘巴黎’和‘閃秋’葉片和葉柄作為外植體,在各自適宜培養基的條件下(葉片為MS+0.5 mg∕L 6-BA+0.1 mg∕L NAA,葉柄為MS+0.2 mg∕L 6-BA+0.1 mg∕L NAA),光照培養10 d 左右(即培養30 d 左右),外植體傷口附近均能夠出現淺綠色的凸起,表明外植體已經開始進行不定芽的分化;經過50 d 左右的培養,分化獲得的不定芽形態十分明顯(圖1、圖2)。

由表3 可知,隨著植物生長調節劑濃度的增加,礬根葉片不定芽再生率和不定芽數均呈現先上升后下降的趨勢,低濃度處理效果優于高濃度。 而6-BA 的處理效果要優于TDZ,前者處理的‘巴黎’平均不定芽再生率為59.38%,‘閃秋’為67.71%,遠高于后者的22.92%和28.13%。 兩個品種的葉片再生不定芽情況均在0.5 mg∕L 6-BA 的培養基上表現最佳,礬根的不定芽再生率達到最高,‘巴黎’為62.50%,‘閃秋’為75.00%。 與此同時,不定芽數也最多,分別為20.50 個和21.25 個。 綜上,MS +0.5 mg∕L 6-BA +0.1 mg∕L NAA 是礬根葉片產生不定芽的最適培養基。

表3 不同濃度TDZ 與6-BA 對礬根葉片不定芽再生的影響Table 3 Effects of different concentrations of TDZ and 6-BA on the adventitious shoot regeneration from leaf blades of H. spp.

由表4 可知,隨著TDZ 及6-BA 濃度的增加,礬根葉柄不定芽再生率和不定芽數均呈現下降趨勢。 且6-BA 的處理效果要優于TDZ,前者處理的‘巴黎’平均不定芽再生率為81.25%,‘閃秋’為59.90%,遠高于后者處理的34.38%和14.06%。 在0.2 mg∕L 6-BA 的培養基上,礬根‘巴黎’和‘閃秋’的葉柄再生不定芽情況表現最佳,分別為89.58%和77.08%,不定芽數也最多,分別為28.50 個和12.50 個。 ‘巴黎’的再生情況略優于‘閃秋’。 綜上,MS +0.2 mg∕L 6-BA +0.1 mg∕L NAA 是礬根葉柄產生不定芽的最適培養基。

表4 不同濃度TDZ 與6-BA 對礬根葉柄不定芽再生的影響Table 4 Effects of TDZ and 6-BA concentrations on the adventitious shoot regeneration from petioles of H. spp.

3 討論

不同基因型礬根屬植物愈傷組織誘導效果不同。 紅花礬根(H.sanguinea)葉柄在MS +4.40 μmol∕L 6-BA +0.19 μmol∕L NAA 培養基上的愈傷組織誘導率最高可達90%[12];而礬根(H.micrantha)葉柄在MS+6-BA 0.5 mg∕L 的培養基上愈傷組織誘導率僅為19%[9]。 田莉等[10]以礬根‘巴黎’葉柄作為起始擴繁材料,經過60 d 左右的誘導及分化培養,獲得的不定芽分化率為81.25%,相對較低,且操作復雜,污染幾率大。 本文建立的方法適用于兩種不同的礬根品種,其外植體在同一種培養基上經過50 d 左右的培養可獲得不定芽,是今后進行礬根屬植物不定芽再生研究的首選方法之一。

光照對植物器官的形成具有誘導作用,外植體在暗培養下進行脫分化,在光照培養下進行再分化,最終可形成愈傷組織和不定芽[13-14]。 在蝴蝶蘭、棗樹等的研究中發現,適當長度的暗培養有利于不定芽的再生[15-16]。 本研究結果表明,暗培養時間過短或過長均不利于礬根不定芽再生,21 d 是礬根不定芽再生的最佳暗培養時間。

植物生長調節劑的種類、濃度與配比是調節外植體形成愈傷組織或不定芽的重要影響因素[17-18]。 田莉等[10]研究顯示,低濃度的NAA 更適宜礬根‘巴黎’愈傷組織的誘導,且在MS +0.5 mg∕L 6-BA +0.5 mg∕L NAA 培養基上僅產生愈傷組織,無法分化獲得不定芽[10]。 鄒清成等[19]利用礬根葉片作為外植體,在MS+2.0 mg∕L 6-BA +0.1 mg∕L NAA 培養基上誘導獲得愈傷并進一步形成不定芽,分化率為68.67%,相對較低。 礬根‘巴黎’和‘閃秋’在MS+2.0 mg∕L 6-BA+0.1 mg∕L NAA 培養基上,誘導率不高的同時還會出現一定程度的玻璃化現象,會對后續獲得種苗的質量產生不利影響。 本研究結果表明,多種植物生長調節劑的復合使用,能夠達到在同一種培養基上完成脫分化和再分化過程的效果,使礬根獲得較高的不定芽再生率。 培養基中添加的NAA 能夠與細胞分裂素相互作用促進礬根愈傷組織的誘導;添加TDZ 或6-BA 能夠有效促進礬根不定芽的分化。 但是,若植物生長調節劑濃度過低,則不能夠有效促進外植體再生,濃度過高,則易產生玻璃化問題[1]。 本研究建立的礬根不定芽再生方法,利用含有較低濃度植物生長調節劑的培養基,結合光照條件的變化(21 d 暗培養和30 d 光照培養),葉柄和葉片兩種外植體上均再生出優質的礬根不定芽。 該方法在獲得較高不定芽再生率的同時解決了不定芽的玻璃化問題,并可減少變異產生,不定芽再生效果良好。

綜上,本研究以葉柄和葉片作為外植體,通過開展不同暗培養時間以及不同植物生長調節劑種類和濃度對礬根不定芽再生影響的研究,建立了一種取材范圍更廣且更為簡便、經濟且有效的礬根不定芽再生方法。 該方法可以克服以芽作為起始擴繁材料的局限,進一步擴大了外植體取材范圍;提高礬根的不定芽再生率(礬根‘巴黎’高達89.58%);在同一種培養基上經誘導和分化直接再生獲得不定芽,有效簡化操作并節約生產成本。 同時,優化了礬根不定芽高效再生體系,能夠為種苗的快速繁殖、新品種培育以及利用基因工程手段進行性狀的改良提供良好的技術支持。 本研究顯示,礬根葉柄比葉片更容易誘導產生不定芽,但在相同外植體個數下獲得的不定芽數量在不同品種間具有差異。 針對特定礬根品種,可對其葉柄和葉片誘導產生的不定芽數量進行比較,從而確定該品種不定芽再生的最佳外植體材料。