蚯蚓對連作與輪作西瓜土壤細菌群落、微生物量和酶活性的影響

張翰林,郭惠寶,白娜玲,張娟琴,鄭憲清,李雙喜,張海韻,呂衛光*

(1 上海市農業科學院生態環境保護研究所,上海201403;2 農業部上海農業環境與耕地保育科學觀測實驗站,上海201403;3 上海市設施園藝技術重點實驗室,上海201403;4 上海光明長江現代農業有限公司,上海202178)

我國西瓜種植面積居世界第一位,每年約在100 萬—120 萬hm2。 西瓜連作模式特別是大棚溫室連作栽培,破壞了土壤微生態環境,引起有益菌種群結構的改變和數量降低,導致了嚴重的連作障礙[1-3],如何有效緩解連作西瓜土壤障礙已成為西瓜生產的當務之急,對保障食品安全、減少產地環境污染具有重大的理論和實際價值。 目前西瓜土壤連作障礙的防治與緩解措施主要有抗病品種培育,農業管理措施,化學防治和微生物防治[4-6]。 以上措施均具有一定的效果,但也均有各自的局限性,如時耗較長、投入品易造成二次污染等。 因此,開發生態高效的西瓜土壤連作障礙調控新方法,并對其調控效果進行研究具有十分重要的意義。

蚯蚓在改善土壤物理性狀,促進土壤養分循環,調控土壤微生物群落結構與生態功能等方面均已有所報道,這為其修復農作物土壤連作障礙從理論上提供了可行性[7-8]。 目前利用蚯蚓開展連作障礙修復的研究主要是采用蚯蚓糞便或蚯蚓堆肥,Szczech[9]發現蚯蚓堆肥可有效抑制番茄病原體,其效果與蚯蚓堆肥添加量呈正相關,且蚯蚓堆肥中微生物發揮了主要的抑制作用;蚯蚓堆肥也可以顯著降低西瓜與番茄枯萎病的發病率,改善果實品質[10];此外,添加蚯蚓糞也可以顯著增加設施番茄、韭菜土壤三大菌的數量,提高土壤細菌多樣性以及土壤酶活性[11]。 直接采用蚯蚓活體對連作障礙土壤進行修復目前尚處于試驗性階段,相關研究還并不多見。

本研究在西瓜連作土壤中接種蚯蚓,1 個月后分析土壤理化性質、土壤細菌群落多樣性與酶活性,探討接種蚯蚓對西瓜連作土壤障礙的修復改良作用,為修復連作西瓜土壤障礙開拓新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤來源:土壤來自于上海市農業科學院莊行試驗站西瓜種植大棚,在2017 年6 月西瓜收獲后取樣。種植西瓜品種為早春紅玉,障礙土壤取自3 年西瓜連作大棚內,大棚內西瓜產量已大幅減少30%—50%,輪作土壤取自旁邊西瓜-蔬菜輪作大棚內,取樣深度均為0—20 cm。 供試土壤類型為潮土。 試驗所用障礙土壤基本理化性狀:全氮3.1 g∕kg,全磷1.0 g∕kg,全鉀6.2 g∕kg,pH 7.89,EC 0.11 mS∕cm,有機質18.7 g∕kg;試驗所用輪作土壤基本性狀:全氮2.9 g∕kg,全磷2.1 g∕kg,全鉀11.8 g∕kg,pH 7.27,EC 0.66 mS∕cm,有機質37.4 g∕kg。

蚯蚓來源:試驗品種為威廉環毛蚓(Pheretima guillelmi),取自于上海市農業科學院崇明試驗基地。 選取個體大小一致,質量在2 g 左右的成年蚯蚓進行試驗。

試驗容器:選用底部直徑為20 cm、高為25 cm 的圓柱形鐵桶作為試驗容器。 底部打4 個孔,四周打8個孔,底部和四周打孔處內附50 目(篩孔孔徑270 μm,下同)細紗網,容器上口同樣采用50 目細紗網覆蓋防止蚯蚓逃逸。

1.2 試驗設計

為了研究蚯蚓接種密度對修復效果的影響,試驗共設置6 個處理,分別為輪作土壤對照(NCK)、輪作土壤+500 條∕m2蚯蚓(N1)、輪作土壤+1 000 條∕m2蚯蚓(N2)和障礙土壤對照(DCK)、障礙土壤+500 條∕m2蚯蚓(D1)、障礙土壤+1 000 條∕m2蚯蚓(D2),每個處理設置3 個重復。 其中對照處理不接種蚯蚓,500 條∕m2蚯蚓處理每個試驗容器接種15 條蚯蚓,1 000 條∕m2蚯蚓處理每個試驗容器接種30 條蚯蚓。 保持試驗溫度在25 ℃,維持土壤表面濕度在65%—70%。

1.3 樣品采集

在土壤培育1 個月后對將容器內土壤混勻后取樣。 土壤一部分進行風干,測定土壤理化性質,另一部分土壤保存在-20 ℃,進行土壤DNA 提取及后續變性梯度凝膠電泳分析。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 土壤理化性質及酶活性測定

土壤總氮和速效氮均采用2 mol∕L 氯化鉀溶液浸提,按照凱氏定氮法測定;總磷采用酸溶-鉬銻抗比色法(5 mol∕L 硫酸浸提),速效磷采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測定(0.5 mol∕L 碳酸氫鈉溶液浸提);全鉀采用氫氧化鈉熔融法-火焰光度計法,速效鉀采用乙酸銨提取-火焰光度計法測定(1 mol∕L 乙酸銨溶液浸提);土壤微生物生物量碳氮采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法測定[12];pH 采用電位法測定(水土體積比2.5∶1),有機質采用重鉻酸鉀容量法測定。

土壤脲酶活性采用靛酚藍比色法測定,蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定,過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定[8]。

1.4.2 變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析

取0.5 g 土壤樣品,使用Soil DNA Kit(50)(OMEGA)提取土壤DNA。 DNA 提取及純化后采用0.7%瓊脂 糖 凝 膠 檢 驗。 土 壤 DNA 采 用 細 菌 16 S rDNA 的 V3 區 通 用 引 物 F341GC (5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG CCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和R517(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)進行PCR 擴增。 PCR 采用25 μL 體系:10 ×PCR buffer 5 μL(with MgCl2),dNTP 0.5 μL,引物各0.5 μL,Tap 酶0.25 μL(250 U),模板1 μL。 采用降落PCR 策略[13]:96 ℃預變性5 min,之后94 ℃1 min,55—65 ℃1 min,72 ℃3 min,20 個循環,每個循環后復性溫度下降0.5 ℃,后接94 ℃1 min,55 ℃1 min,72 ℃3 min,10 個循環,最后72 ℃延伸7 min。 DGGE 電泳采用8%濃度的聚丙烯酰胺凝膠,變性梯度為40%—60%,在60 ℃條件下,60 V 電泳12 h。 電泳結束后進行SYBR Green I 染色,用BIO-RAD 凝膠成像系統拍照觀察。

1.5 數據處理

DGGE 圖譜通過Quantity One 軟件進行分析,采用其中的UPGAMA 程序進行微生物群落結構的聚類分析。 微生物群落多樣性通過Shannon-Weaver 指數(H′)來表示,計算公式為:

式中,Pi為第i 個條帶出現的概率,Ni為第i 個條帶的序列擴增量,N 為所有條帶的擴增總量(N =ΣNi),S 為DNA 序列豐富度指數,即單條泳道的條帶數。

2 結果與分析

2.1 接種蚯蚓對連作西瓜土壤化學性質的影響

由表1 可知,接種蚯蚓處理均顯著提升了連作土壤EC 和降低速效磷(P ＜0.05),其中1 000 條∕m2蚯蚓處理還可以顯著提升連作土壤速效氮和速效鉀(P ＜0.05)。 在輪作土壤中,接種蚯蚓均顯著提升了土壤速效磷,降低了輪作土壤EC、有機質、全氮(P ＜0.05),1 000 條∕m2蚯蚓處理則還顯著降低了土壤全磷,提升了土壤速效氮和速效鉀(P ＜0.05)。

2.2 接種蚯蚓對連作西瓜土壤微生物量和酶活性的影響

經蚯蚓處理后,土壤微生物量碳氮在不同土壤中變化趨勢相反(表2)。 在輪作土壤中,蚯蚓處理后微生物量碳氮與微生物碳氮比均有顯著降低(P＜0.05)。 與NCK 相比,微生物量碳氮分別降低了18.0%—19.3%和15.7%—16.7%。 而在連作障礙土壤中,蚯蚓處理后微生物量碳氮均有顯著提升,微生物碳氮比則同樣顯著降低(P＜0.05)。 與DCK 相比,微生物量碳氮分別提高了8.2%—11.4% 和68.9%—75.1%。 不同蚯蚓接種數量對土壤微生物量碳氮含量則沒有顯著影響。

表1 蚯蚓處理后土壤化學性質Table 1 Soil chemical properties after earthworm treatments

表2 蚯蚓處理后土壤微生物量碳氮Table 2 Soil microbial biomass carbon and nitrogen contents after earthworm treatments

蚯蚓處理后的土壤酶活性見表3。 蚯蚓處理后蔗糖酶、脲酶和過氧化氫酶酶活性均顯著提高,與連作障礙土壤和輪作對照相比,蔗糖酶分別提高了69.4%—108.3%和26.0%—38.4%,脲酶分別提高了46.0%—71.8%和21.5%—42.6%,過氧化氫酶則分別提高了41.0%—59.0%和22.6%—46.1%。 且隨蚯蚓接種數量的增加,三種酶活性也均顯著提升(P＜0.05)。

表3 蚯蚓處理后土壤酶活性Table 3 Soil enzyme activities after earthworm treatments

2.3 接種蚯蚓對連作西瓜土壤細菌群落多樣性的影響

基于DGGE 圖譜,采用Quantity One 對其進行分析計算,得到土壤細菌群落的多樣性指數H′(圖1)。 與連作土壤和輪作土壤對照相比,蚯蚓處理提高了多樣性指數H′,且1 000 條∕m2蚯蚓處理均高于500 條∕m2蚯蚓處理,但連作土壤經蚯蚓修復后,其細菌群落多樣性依然低于輪作土壤對照處理。

對DGGE 圖譜進行UPGMA 聚類分析的結果如圖2 所示。 接種蚯蚓對西瓜土壤細菌群落結構影響顯著。 N1 和N2 受蚯蚓的影響相似度最高,為78%,而在連作障礙土壤中接種蚯蚓使得細菌群落結構逐步趨近于輪作對照處理,D1 和D2 與NCK 的細菌群落結構相似度分別為58%和64%,DCK 則與其他處理差異最大,群落結構相似度僅為54%。

土壤細菌多樣性指數H′、酶活性與土壤化學性質的相關性分析見表4。 細菌多樣性指數H′與土壤速效氮(P＜0.01)、有機質、全氮、全磷(P＜0.05)呈顯著正相關,過氧化氫酶、轉化酶和尿酶的相關性分析結果一致,均與pH 呈顯著負相關(P＜0.01),與速效氮呈顯著正相關(P＜0.01)。

表4 土壤細菌多樣性指數、酶活性與土壤化學性質的相關性分析Table 4 The correlation between H′,soil enzyme activities and soil chemical properties

3 結論與討論

蚯蚓對土壤理化性質的影響顯著,有研究顯示,蚯蚓可顯著降低鹽漬化土壤EC,改良濱海農田土壤[14],促進土壤中磷素的分散化分布,增加土壤速效磷含量[15],這與本研究中蚯蚓對輪作土壤的影響相符。 作物連作易造成土壤養分不均衡,如氮素或磷素的過量積累[16],導致作物減產、抗逆性降低。 本研究中,與NCK 相比,DCK 速效磷含量提高了16.0%,出現了過度積累,而在EC、有機質、全量氮磷鉀和速效氮鉀則均顯著降低。 在障礙土壤中接種蚯蚓,顯著提升了EC、速效鉀,并降低了由于連作而導致的過量速效磷含量,有效的平衡了土壤養分狀況。 D2 與D1 相比,顯著提升了速效氮含量,但整體土壤養分水平依然低于NCK。 土壤EC 代表了土壤水溶性鹽的含量水平,與土壤養分礦化關系緊密。 一般來說,EC 在0.4—1 時最適宜作物生長。 接種蚯蚓后,由于其吞食過程,消耗了部分輪作土壤的水溶性鹽,使其降低;但在連作土壤中,已經出現EC 過低的障礙情況(0.16),蚯蚓可能通過其吞食與挖掘活動,促進部分不溶性鹽轉化為可溶性鹽,改善了土壤理化環境[14]。

土壤微生物量碳氮是反映土壤微生物數量與活性的重要指標[7]。 有研究顯示蚯蚓由于吞噬作用和分泌黏液對部分微生物的抑制作用,導致微生物總量減少,降低了微生物量碳氮[17-18],這與本研究輪作土壤中結論一致。 也有研究發現,經過4 年田間小區定位實驗后,蚯蚓會顯著提升稻麥輪作系統土壤微生物量碳氮的水平[19],這可能是由于有作物根系參與其中,且實驗的區域范圍與時間長度都遠遠超過本研究。 在連作障礙土壤中,則可能是因為接種蚯蚓改善了土壤理化性質,平衡了由于西瓜連作造成的土壤養分失調(表1),改善了土壤理化條件,有效促進了土壤微生物生長,進而提高了土壤微生物量碳氮含量[20]。

土壤酶活性是衡量土壤養分循環能力的重要指標[7]。 陶軍等[21]發現,秸稈還田條件下,接種蚯蚓顯著提高了稻麥輪作土壤中的蛋白酶和蔗糖酶活性;鄭憲清等[22]通過對利用蚯蚓進行生物耕作的菜田進行研究發現,土壤過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性均顯著提高,且生物耕作的時間越長影響越大。 蚯蚓一方面通過改變土壤養分水平,如有機質、速效養分等,促進微生物活性提高,從而提升土壤酶活性。 在本研究中土壤酶活性與土壤速效氮含量顯著正相關(表4),蚯蚓在提升土壤速效養分的同時,也增加了酶活性;另一方面,大量蚓糞的產生也帶來了豐富的養分與微生物,這也是促進土壤酶活性提高的一個重要因素[11]。 本研究還發現,接種蚯蚓對連作障礙土壤酶活性的提升程度均高于輪作土壤,且D2 修復后土壤酶活性水平已經達到甚至超過NCK,表明接種蚯蚓可以有效緩解連作障礙造成的酶活性低下的情況。

連作西瓜土壤障礙的一個主要表現就是微生物群落多樣性下降,細菌數量下降而真菌數量上升,導致微生物群落結構與功能失調[23],因此,改善土壤微生物群落結構有助于緩解土壤連作障礙。 本研究中,蚯蚓處理后,輪作土壤和連作障礙土壤中細菌群落多樣性指數H′均有所提升,表明無論是障礙土壤還是健康土壤,蚯蚓均可以顯著改善土壤細菌群落結構,與前人研究結果相似。 于建光等[24]發現,在紅壤當中接種蚯蚓,微生物基質利用豐富度指數和多樣性指數顯著增大;Aira 等[25]在72 h 短期基質降解實驗中也得到了相同的結論。 但連作障礙土壤經蚯蚓處理后,其多樣性指數H’接近但還依然低于NCK,聚類分析也展示了類似結果,D1 和D2 處理細菌群落結構向NCK 趨近,尤其是1 000 條∕m2蚯蚓數量修復連作障礙土壤效果明顯,但與輪作健康土壤細菌群落結構尚有一定差別。 本研究中,蚯蚓接種密度越大,其改善土壤理化及微生物狀況的效果就越好,提升土壤速效養分,并正向的改變了土壤細菌群落結構。 但過高的蚯蚓接種密度可能會降低土壤全量養分,礦化速度過快,造成養分流失[26]。 在未來的研究中,一方面還需要應用宏基因組等手段,明確具體微生物群落結構差異種屬及其生態功能,另一方面還需要在蚯蚓密度方面開展細化研究,探索改善障礙土壤的最佳接種密度,進一步為接種蚯蚓緩解西瓜連作土壤障礙提供理論基礎。

綜上所述,在西瓜連作土壤中接種蚯蚓可以顯著改善由于連作造成的土壤養分失調、微生物數量降低、細菌群落結構受到破壞等障礙問題,蚯蚓接種密度為1 000 條∕m2時改善效果優于500 條∕m2。