牛的胚胎移植技術

吳長玉，王廷斌，孫明林

（1.富錦市種畜場，黑龍江 富錦 156100；2.佳木斯市家畜繁育指導站，黑龍江 佳木斯 154007）

對于家畜的遺傳改良，胚胎移植能從基因層面更好的展示母畜的優良血統。胚胎移植技術距今已有110 多年的研究發展歷史。雖然人工授精技術已經廣泛應用于家畜的遺傳改良，但是胚胎移植也已證明是一種極為強大的技術手段，特別是用于優良血統母畜的基因擴繁。對于奶牛業，推廣優良母牛采用超數排卵和胚胎移植（MOET），能促進良種繁育。

1 激素處理

對牛進行單個胚胎的收集，通常在對超排供體母牛進行激素處理后，再進行大量的胚胎移植。在牛，有兩種超數排卵（超排）技術：一種是在發情期第10 天肌內注射PMSG 2 000～2 500 U，之后2～3 d 每隔12～24 h 注射2 次前列腺素PGF2α。發情牛需做直腸檢查，以確認卵泡，若在發情后1.5 d以后排卵的不能用作受體牛。

使用PMSG的超排效果強于FSH，但使用FSH得到的胚胎質量卻更高，所以商業上常使用FSH進行超排。商業應用的FSH 來自豬腦垂體提取物，混有LH。然而如果混有過多LH干擾FSH的最佳超排效果，但是少量的LH反而更有利于FSH的超排效果。

據報道稱，一次性注射FSH可以獲得滿意的結果，但應連續肌內注射FSH 4～5 d，每日2次為最佳。商業用FSH用生理鹽水稀釋到20 mL，然后連續使用4～5 d。使用FSH 注射4 d 的方法是：第1 天4 mL·次-1，2 次·d-1；第2 天3 mL·次-1，2次·d-1；第3天2 mL·次-1，2次·d-1；第4天1 mL·次-1，2 次·d-1，總量為20 mL。出現發情后第10 天應用FSH。應用FSH后第3天或第4天注射PGF2α，12 h后重復1次。36～48 h后出現發情，發情開始后12及24 h觀察體溫變化，以進行人工授精，或在72、84、96 h 應用HCG 或GnRH 促進排卵。對奶牛可用的超排方法很多。比如超排前注射雌二醇或者陰道抽取優勢卵泡。這些方法的目的是獲得更多可用胚胎。

2 受體處理

觀察到供體自然發情后，應同步對受體進行處理。供體牛和受體牛的比例一般為1：6～8。受體要選擇體格大，膘情好，繁殖機能正常的適繁健康母牛。在移植前6～8周，對受體母牛逐頭注射VA、VB、VD、VE 針劑，補充微量元素。在供體首次注射PGF2α12 h之前受體應注射PGF2α，受體會與供體同期排卵，但通過比較，供體與受體注射PGF2α相差±1 d比較好。超排率可以達到75%～90%，但20%～30%超排的母牛所產胚胎質量不好。使用FSH可以獲得高質量的胚胎（每次能沖洗出0～20 個胚胎）。每次收集胚胎平均能獲得5～7個高質量的胚胎，即可認為是滿意的商業結果。

3 胚胎采集和處理

可在發情周期第7 天即胚胎定植子宮時進行胚胎采集。在采集胚胎之前，超排之后供體母牛觸診子宮可摸到黃體。從子宮液中采集胚胎方法如下：5～7 mL利多卡因硬膜外腔麻醉；使用肥皂或消毒劑洗凈外陰，用量依據動物及其子宮頸大小，將安裝有金屬桿的導尿管插入陰道，用伸入直腸的觸診手臂將導尿管導入子宮頸；插入子宮頸后，將導尿管深入到一側子宮角上1/3處；取出導尿管里的金屬桿，管口充滿15～20 mL 空氣，空氣量與子宮角大小有關，也與品種、年齡、胎次等有關；子宮頸中含有沖洗液，該液體富含抗生素及牛血清白蛋白，有些還有表面活性劑以減少胚胎形成泡沫；用沖洗液沖洗子宮角，每次25～50 mL，少量重復多次，將沖洗液導入胚胎濾器，可持續沖洗子宮角，或使用1～2 L沖洗液連續沖洗子宮；沖洗完成后，沖洗液會流入胚胎濾器中；胚胎濾器送到實驗室后，應將其內容物放入檢查盤中，可在10倍解剖顯微鏡下觀察。將所有觀察到的胚胎移入到另一個干凈培養皿中，培養皿中有含有10%～20%胎牛血清或0.4%牛血清白蛋白的緩沖液。然后在40～60倍的高倍鏡下觀察胚胎，依據胚胎形態、發育程度（未受精卵母細胞、早期桑葚胚、緊密桑葚胚、胚泡、擴張胚泡、孵出胚泡等）、質量（優秀、良好、一般、差劣、變質）進行分類。質量判定依據胚胎的完整性、胚胎發育情況、細胞質顏色、細胞退化、卵裂球數量、卵周隙距離和胚胎大小等形態特征進行評估。

只有中等、良好或優秀的胚胎可以移植；至少清洗胚胎3遍之后將其保存在培養液中。將移植的胚胎移入干凈的含有培養液的器皿中，目的是剔除細胞碎片及可能黏附在透朋帶上的病原體。在室溫下保存胚胎，直到移植入受體中或冷凍或進行性別判斷。

4 胚胎植入

胚胎移植時可用0.25 mL細管分3段吸入PBS保存液，中間由2個氣泡隔開，中斷含有胚胎。胚胎移植槍放在無菌的套子里，以避免移植槍頭部對動物會陰部和陰道造成污染。借助于直腸檢查，將移植槍送入子宮頸，然后再插入同側帶有黃體的子宮角。細管里的胚胎等內容物要盡量置于細管頂端，以避免延長不必要的手術時間。第1次接受胚胎移植后，60%～70%的受體可以妊娠，移入2 個胚胎的受孕率可高達90%。大量的牛移植胚胎都是經過良好處理的凍融胚胎（46%），一般的受孕率＞50%。在同樣的條件和熟練的操作技術下，凍融胚胎理論上比新鮮移植的胚胎受孕率低10%。孕酮具有保胎作用，注射孕酮，可提高受胎率。早期確診的方法有放射免疫測定和酶聯免疫測定。雖然移入的胚胎量越多動物的妊娠率越高，但是由雙胎引起的難產和胎衣不下的危險率也會增高，而且由此而導致的異性孿生不孕的可能性增高，從而限制了這種方法的廣泛應用。