細胞培養條件探討

戴志亮 劉賢旭 張 君

（廣東科貿職業學院，廣東廣州 510430）

大部分生物產品是從細胞培養生成，所以一定程度來說細胞培養技術是生物技術中最基礎和較為核心的技術[1]。本文對細胞培養的基本條件、凍存與細胞復蘇和細胞培養簡單進行一個探討。

1 細胞培養的基本條件

1.1 無菌設計與無菌操作

1.1.1 實驗室設計及設備

細胞培養室的設計原則是防止微生物污染和有害因素干擾，要求空氣清新、干燥、無塵煙。一般無菌操作區設在走動較少的內側，常規操作和封閉培養于一室，洗刷消毒在另外一室。需要設置區域有：更衣間、緩沖間、操作間。其中操作間放置超凈工作臺、倒置顯微鏡、離心機、二氧化碳培養箱、電冰箱、放置無菌物品的架子等[2]。

1.1.2 無菌操作

主要分為三個部分：工作環境維護，細胞培養用的玻璃制品的處理，培養液及培養細胞的處理。

工作環境維護包括：實驗前超凈工作臺打開紫外燈照射30min滅菌；進入超凈工作臺的物品要用75% 酒精噴灑，擦拭，即可，每次只能處理一種細胞，以免造成交叉感染；實驗結束后要將細胞器皿清理出臺面，然后用酒精擦拭臺面。必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以暫時放置，其它實驗用品用完后應及時移出，以利氣體流通；操作時切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要在打開的容器正上方操作實驗；工作人員必須穿戴實驗服與手套后才進行實驗；定期檢查C02鋼瓶內的C02壓力；C02培養箱內的CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染；無菌操作臺內氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及HEPA過濾器濾膜，預濾網；玻璃制品的處理：在組織細胞培養中，體外細胞對任何有害物質都非常敏感。微生物產品附帶雜物，上次細胞殘留物及非營養成分的化學物質，均影響培養細胞的生長。因此對新使用玻璃器皿和重新使用的培養器皿都要嚴格徹底的清洗并做好消毒工作。

培養液及培養細胞的處理：細胞培養用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水；胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。在pH為8.0、溫度為37 °C時，胰酶溶液的作用能力最強。使用胰酶時，應把握好濃度溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。

1.2 溫度及氣體條件

1.2.1 溫度的影響

維持培養細胞旺盛生長，必須有恒定而適宜的溫度，不同種類的細胞對培養溫度要求也不同。哺乳動物細胞培養的標準溫度為36.5°C±0.5°C，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；哺乳動物細胞在39～40℃ 1h，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復；在40～41℃1h，細胞會普遍受到損傷，僅小半數有可能恢復；41～42℃ 1h，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1h，細胞全部死亡[3-5]。

相反，溫度不低于0℃時，對細胞代謝雖有影響，但并無傷害作用；把細胞放入25～35℃時，細胞仍能生存和生長，但速度減慢；放在4℃數小時后，再回到37℃培養，細胞仍能繼續生長，細胞代謝隨溫度降低而減慢。當溫度降至冰點以下時，細胞可因胞質結冰受損而死亡。但是，如果向培養液中加入一定量的冷凍保護劑（二甲亞砜或甘油），可在深低溫下如-80℃或-196℃（液氮）長期保存。

1.2.2 氣體條件需求

氣體是哺乳動物細胞培養生存必須條件之一，所需氣體主要有95% O2+ 5% CO2。適當的CO2是有利于細胞生長的，如果完全沒有CO2，細胞也會像人一樣出現醉氧的；CO2對細胞培養液中的PH值有著重要意義，CO2可以融入到培養液中，也可以從中釋放，這取決于細胞的生長狀態和環境變化，碳酸根離子也是常見的緩沖離子，對維持細胞穩定的生長環境至關重要。

2 細胞凍存與細胞復蘇

2.1 細胞凍存

所謂冷凍保存，就是將體外培養物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養的器官都可以進行凍存，并在適當條件下復蘇。

水在低于零度的條件下會結冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細胞內外的水分都會結冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復溫速率有關。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。

從實際和效益的觀點出發，液氮溫度（-196℃）是目前最佳的冷凍保存溫度。在-196℃時，細胞的生命活動幾乎完全停止，但復蘇后細胞的結構和功能完好。如果冷凍過程得當，一般生物樣品在-196℃下均可保存十年以上。目前應用較廣的冷凍保護劑是DMSO，但在常溫時對細胞毒害作用較大，因此在細胞復蘇后及時洗滌冷凍保護劑。

操作方法如下：

2.1.1 待冷凍細胞懸液的制備

（1）按常規方法消化處于對數生長期的細胞培養物，制備單細胞懸液，并計算細胞總數；（2）將細胞懸液以800～1000r/min離心5min，去上清夜；（3）向細胞沉淀物中加入冷凍保護液，輕輕吹打混勻，使細胞密度達1×106～1×107個/ml；（4）按每管1～1.5ml的量分裝于凍存管內，擰緊管蓋；（5）再凍存管上做好標記，包括細胞代號及凍存日期。

2.1.2 分級冷凍

（1）先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～8°C），約40min；（2）接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-10～-20℃），約30～60min；（3）將凍存管轉入低溫冰箱（-30℃），放置30min左右；（4）然后將凍存管轉移到超低溫冰箱（-70～-80℃），過夜；（5）最后將凍存管投入液氮保存。

2.1.3 記錄

做好凍存記錄。記錄內容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。

2.2 細胞復蘇

（1）調配37～40℃的溫水，或將恒溫水浴箱的溫度調節至37～40℃；（2）從液氮中取出凍存管，立即投入37～40℃溫水中迅速晃動，直至凍存液完全溶解；（3）將細胞凍存懸液轉移到離心管內，加入約5ml培養液，輕輕吹打混勻；（4）將細胞懸液經800～1000r/min離心5min，棄上清夜；（5）向細胞沉淀內加入完全培養液，輕輕吹打混勻，將細胞懸液轉移到培養瓶內，補足培養液進行培養。

3 細胞培養方法

3.1 一般體細胞培養方法

其傳代程序為：（1）吸除舊培養液注入另瓶中；（2）用溫PBS沖洗2～3次；（3）用0.25%溫胰蛋白酶置37℃消化，加入消化液量以僅覆蓋細胞層即可：作用1～5min；（4）待細胞附著松動、細胞質邊緣卷起和間隔加大，便終止消化；（5）加入培養液后，用玻璃吸管輕輕反復吹打制成單個細胞懸液，應避免吹出氣泡；（6）按所需比例比例接種到新培養皿于37℃培養。

3.2 懸浮培養法

某些細胞要求懸浮培養，否則不能存活。舉例High five 細胞：

（1）細胞計數，培養密度控制在0.8～1.0 106cells/ml以下，置于27°C培養箱中培養，搖床轉速100～130rpm，每48h進行傳代（正常速率為48h增長為5～7倍）。

（2）當密度大于0.8～1.0×106cells/ml，觀察細胞狀態是否健康良好，則可以一分為二，加入新鮮培養基至200ml刻度。

3 結論

細胞培養經過了長時間的摸索和實踐，已經得到了進一步的完善和發展，隨著生物科技的快速發展，如細胞雜交、DNA介導的基因轉移以及一些物理圖譜的建立，也都與細胞培養緊密聯系在一起，還已經涉及到生物學、農業、環境保護等諸多領域[6]。細胞培養技術是基礎中基礎，是細胞培養及其延伸的各行各業各領域中不可或缺的一環節，想要更好的實驗結果實驗產品更加離不開基礎的細胞培養技術操作原理。