骨髓間充質(zhì)干細胞治療股骨頭壞死的研究進展

袁銀鵬，王新軍，王宇澤

山西醫(yī)科大學(xué)，太原030001

股骨頭壞死(ONFH)是一種臨床常見病和多發(fā)病，治療難度大，且發(fā)病率逐年升高，在我國，15歲及以上普通人群中約有812萬人患有非創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死(ANFH)，各種創(chuàng)傷進一步提高了ANFH的發(fā)生率。臨床表現(xiàn)為患者患側(cè)下肢疼痛難忍，活動受限，嚴重影響患者的學(xué)習(xí)、工作和生活。目前，有關(guān)ONFH形成因素的假說很多，但確切機制尚不清楚，公認的有長期大量飲酒、長期大劑量使用糖皮質(zhì)激素、車禍傷、老年人意外摔傷等多種因素。研究普遍認為，以上這些病因?qū)е鹿晒穷^內(nèi)高壓或股骨頭內(nèi)營養(yǎng)血管堵塞，從而導(dǎo)致血液供應(yīng)不足，最終發(fā)展為ONFH[1]。由于股骨頭內(nèi)部血液供應(yīng)中斷，導(dǎo)致骨組織細胞死亡，并出現(xiàn)腔隙，隨著時間的推移，與骨細胞死亡相關(guān)的水腫增加了局部骨間壓力，并影響血運重建，致使破骨細胞骨吸收與成骨細胞骨形成出現(xiàn)不平衡，進而降低了修復(fù)界面小梁骨的力學(xué)性能，導(dǎo)致骨小梁在正常負荷下微骨折發(fā)生，最終導(dǎo)致股骨頭不可逆塌陷。目前，ONFH尚無特異性的臨床治療方法，主要治療措施依據(jù)ONFH的臨床分期及患者情況而定。對于Ⅲ期和Ⅳ期，股骨頭塌陷嚴重、髖關(guān)節(jié)毀損且嚴重影響生活質(zhì)量的患者，主要治療方法是髓芯減壓術(shù)[2]、自體髂骨打壓植骨[3]、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)[4]。對于Ⅰ期和Ⅱ期的早期ONFH，股骨頭輪廓良好、未塌陷或尚未發(fā)現(xiàn)明顯塌陷者，主要以高壓氧、體外沖擊波、脈沖電磁場、限制負重、口服藥物、針灸等方法治療，但其治療效果有限。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，在ONFH區(qū)域移植骨髓間充質(zhì)干細胞 (BMSCs)已成為ONFH治療研究的熱點。現(xiàn)就BMSCs治療ONFH的研究進展綜述如下。

1 BMSCs的生物學(xué)特性

BMSCs是骨髓間質(zhì)中的成纖維樣細胞，從骨髓分離并在體外培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)主要為梭形或紡錘形，核質(zhì)比大。BMSCs是干細胞家族中的一員，具有干細胞的共性，即培養(yǎng)過程中貼壁生長、能自我更新、增殖能力強；體外條件培養(yǎng)基中，能被定向誘導(dǎo)分化成成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞、神經(jīng)元細胞等；體內(nèi)應(yīng)用干細胞治療組織缺損損傷時，干細胞可以向局部相應(yīng)的組織遷移并分化為局部組織特定細胞，進而起到修復(fù)功能[5]。體外培養(yǎng)的BMSCs表型鑒定證實，BMSCs表面標志物表達CD105、CD73、CD90，不表達 CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA-DR等[6]。

2 ONFH的發(fā)病機制

盡管ONFH的確切病因以及相關(guān)機制尚未清楚，但目前普遍認為ONFH是由各種因素共同導(dǎo)致股骨頭營養(yǎng)供應(yīng)中斷的結(jié)果，由于ONFH像極了心臟缺血的狀態(tài)，所以有時被稱為“髖關(guān)節(jié)冠狀動脈疾病”[1]。當股骨頭內(nèi)部營養(yǎng)供應(yīng)中斷后，局部骨組織微環(huán)境也隨之發(fā)生變化，導(dǎo)致骨組織細胞死亡，引起局部水腫，局部骨間室壓力增加，并進一步抑制股骨頭壞死局部血液營養(yǎng)的供應(yīng)[1]。而死亡的骨組織促進了破骨細胞活性增強，進而提高局部壞死骨組織的清理，從而破壞破骨細胞促進骨吸收與成骨細胞促進骨形成之間的平衡，降低了修復(fù)界面小梁骨的力學(xué)性能，正常負荷下發(fā)生小梁骨折，導(dǎo)致股骨頭不可逆塌陷[1]；同時，ONFH區(qū)域BMSCs干性相關(guān)基因表達明顯降低、成骨能力顯著下降而成脂能力卻明顯增強[7]。這使得股骨頭內(nèi)BMSCs增殖分化為骨組織修復(fù)骨壞死區(qū)域的可能性極低，由此，外源性BMSCs治療ONFH改善局部微環(huán)境逆轉(zhuǎn)病情成為治療早期ONFH新策略。

3 BMSCs治療早期ONFH的機制

3.1 BMSCs調(diào)節(jié)破骨細胞功能 破骨細胞能在金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)的協(xié)助下高效溶解羥基磷灰石晶體、分解膠原纖維，促進骨基質(zhì)吸收[8]。而BMSCs在調(diào)節(jié)破骨細胞的功能活性方面有重要作用。破骨細胞主要源于骨髓造血干細胞，其細胞膜上存在RANK受體，在周圍環(huán)境中主要受到核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)/核因子-κB受體激活子(PANK)/骨保護素(OPG)軸(RANKL/RANK/OPG軸)的調(diào)控，RANKL和OPG相互競爭性結(jié)合破骨細胞膜上的RANK受體，進而調(diào)節(jié)破骨細胞分化成熟方向[8]。RANKL主要由骨細胞、T細胞和B細胞分泌，當其與RANK 受體結(jié)合后激活NF-κB通路促使破骨細胞分化成熟[8]。此外，巨噬細胞集落刺激因子 (M-CSF)在促進破骨細胞分化成熟過程中發(fā)揮重要作用。相反，當OPG結(jié)合 RANK受體，破骨細胞的分化將會受到抑制，進而影響破骨細胞的成熟。在正常生理狀態(tài)下，將BMSCs與破骨前體細胞共培養(yǎng)時可以促進破骨細胞分化成熟[8]，而M-CSF和RANKL可以劑量依賴性方式增強BMSCs促進破骨細胞發(fā)育成熟[9]。

BMSCs除了促進破骨細胞成熟外，亦能抑制破骨細胞的形成。當成骨細胞系的條件培養(yǎng)基(htROSCM)中加入BMSCs時，破骨細胞的形成則受到抑制。有研究證實CD200+的 BMSCs 群體表現(xiàn)出很強的抑制破骨細胞形成的作用[8]。BMSCs主要通過OPG的表達調(diào)控來抑制破骨細胞形成，ONFH發(fā)生過程中，破骨細胞吞噬骨組織導(dǎo)致局部骨質(zhì)丟失或形成骨缺損，而啟動自體BMSCs修復(fù)骨缺損時，在修復(fù)區(qū)OPG表達明顯增加，抑制破骨細胞活性，加強成骨細胞的功能[10]。此外，外源性給予BMSCs治療ONFH時，能顯著升高OPG水平從而抑制破骨細胞活性[10]。

3.2 BMSCs向成骨方向分化填補骨缺損 BMSCs高度的分化潛能遷移至骨缺損部位，我們稱之為“干細胞的歸巢”，干細胞歸巢到局部后依靠其高度的增殖分化能力分化為成骨細胞，填補缺損[11,12]。有證據(jù)表明，MSC亞群可能具有不同的特征和再生潛能，并且不同的亞群具有促進成骨細胞或軟骨細胞分化的不同潛能[13]。與表面標記物CD105表達量高或未表達CD105的BMSCs相比，表面標記物CD105表達量低的BMSCs在成骨分化和骨再生方面作用更強，這種作用可能是由于TGF-β1/Smad2信號因子表達量降低有關(guān)(CD105表達量高會持續(xù)增加TGF-β1/Smad2信號因子的表達而降低BMSCs在成骨分化和骨再生方面的作用)[14]。進一步研究認為CD105陰性細胞比CD105陽性細胞表現(xiàn)出更強的酸性分泌蛋白表達，富含半胱氨酸(SPARC)和骨連素，這能更加有效地促進鈣沉積而促進骨再生[15]。

3.3 BMSCs的分泌功能促進ONFH區(qū)血管形成 目前普遍認為，ONFH發(fā)生的根本原因是各種致病因素導(dǎo)致股骨頭內(nèi)部營養(yǎng)血管供應(yīng)障礙。如果改善局部血供提供營養(yǎng)將能逆轉(zhuǎn)ONFH病情，促進壞死區(qū)骨再生修復(fù)。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行干細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)時，BMSCs能向血管內(nèi)皮細胞分化。同時，體外和體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，部分藥物或生物材料能誘導(dǎo)BMSCs向血管內(nèi)皮細胞方向分化，如雙相磷酸鈣陶瓷、辛伐他汀[16]，它們聯(lián)合BMSCs能使ONFH骨壞死區(qū)域發(fā)生血管再生，為缺血壞死區(qū)提供營養(yǎng)，進而促進骨再生。該研究對于早期ONFH的治療有重要意義，而臨床治療卻未達到我們所理想的效果，這或許是體內(nèi)存在某些抑制壞死區(qū)再血管化的物質(zhì)而導(dǎo)致血管生成效率低，因此仍需進一步研究。

4 BMSCs治療ONFH的相關(guān)實驗研究

目前，多種干細胞應(yīng)用于ONFH治療研究中，如脂肪間充質(zhì)干細胞，臍帶干細胞和BMSCs等，其中BMSCs最為常用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)條件下，脂肪間充質(zhì)干細胞和BMSCs均能促進成骨細胞分化，前者促成骨分化能力更強，但體內(nèi)實驗證實，脂肪間充質(zhì)干細胞治療ONFH的臨床效果卻明顯低于BMSCs，該結(jié)果的具體機制尚不明確[18]。同時，有研究表明，將直接抽取未經(jīng)分離培養(yǎng)的BMSCs與經(jīng)過分離培養(yǎng)的BMSCs進行ONFH治療比較發(fā)現(xiàn)，兩者對ONFH治療均有效，但后者進行ONFH治療的療效更佳[19,20]。目前，BMSCs移植術(shù)治療ONFH有以下2種:①髓芯減壓細胞移植術(shù)(CD)：是臨床治療手段之一，操作簡單、精準有效，且能聯(lián)合其他材料一起輸送到骨壞死區(qū)，療效肯定[21,22]；②動脈注射法：通過股內(nèi)側(cè)回旋動脈、股外側(cè)回旋動脈或閉孔動脈注射BMSCs，觀察其對ONFH的治療作用，該治療無嚴重不良反應(yīng)[23]，并能提高干細胞的生物力學(xué)支持效果，可有效作用于缺血區(qū)域,提高療效[24]。

盡管BMSCs對于ONFH的治療效果確切，并逐漸走出實驗階段用于臨床，能明顯改善運動功能障礙、緩解疼痛[25]，但BMSCs對于ONFH的治療效果仍未達到預(yù)期的理想結(jié)果(逆轉(zhuǎn)患者病情)[17]，其可能的原因：①細胞方面：細胞活性不佳；細胞流失而停留在壞死區(qū)干細胞達不到治療量等；②壞死區(qū)微環(huán)境：就細胞方面而言，提高BMSCs的活性，降低植入后BMSCs的流失能明顯提高治療效果[8]。研究發(fā)現(xiàn)，利用低強度脈沖超聲處理BMSCs后，在體外能獲得較高細胞活力的BMSCs[26]。而這一研究并未解決細胞的流失問題，且在植入到體內(nèi)前需使用胰酶消化，此對于BMSCs的活性和功能均有不同程度損壞。而基于微載體的3D細胞培養(yǎng)能很好地避免該問題，其作為一個具有功能的微單元增強了細胞-細胞間的相互作用，提高了細胞活性，更重要的是植入到體內(nèi)能降低BMSCs的流失，因此極大提高了再生效果[8]。

就ONFH的局部微環(huán)境而言，改善局部微環(huán)境對于提高BMSCs的治療效果有重要意義。而壞死區(qū)總體處于破骨/成骨細胞失調(diào)、缺血，且壞死區(qū)BMSCs增殖能力和干性基因表達能力明顯降低，相反成脂能力卻明顯增強[1,7]。調(diào)節(jié)局部微環(huán)境就是要調(diào)節(jié)破骨/成骨細胞功能平衡、改善局部缺血及提高ONFH區(qū)的BMSCs功能活性。因此對于需移植的干細胞進行基因修飾能明顯改善骨壞死區(qū)微環(huán)境，使其更好地促進骨再生，提高療效。如在體內(nèi)實驗中，用BMP-2修飾的BMSCs，能通過調(diào)節(jié)破骨/成骨細胞的功能平衡，促進骨再生，進而修復(fù)山羊ONFH，并取得良好效果[27]；BMP-2和BFGF修飾的BMSCs可通過促進骨形成和血管生成而成功修復(fù)犬模型中的ONFH[28]；聯(lián)合BMP-2和VEGF修飾BMSCs治療ONFH的實驗結(jié)果顯示，BMSCs對于壞死區(qū)的血管再生和成骨再生能力明顯增強[29]；且低氧預(yù)處理后的BMSCs能增強干細胞功能活性，使其增殖能力和干性基因表達增強，成脂能力降低[30]。以上研究表明，BMSCs基因修飾和處理后能明顯提高其對ONFH治療效果，這些修飾的共同點是通過修飾后的BMSCs改善ONFH區(qū)局部的微環(huán)境，提高干細胞的治療效果。

綜上所述，BMSCs治療ONFH的研究取得較大進展，并逐漸走出實驗階段應(yīng)用于臨床，但臨床應(yīng)用過程中治療早期ONFH并未達到理想效果；而對BMSCs進行預(yù)處理和準確選擇亞群可提高ONFH的治療效果。利用基因工程技術(shù)對BMSCs(如BMP-2和VEGF)進行修飾，亦為更有效地利用BMSCs提供了良好的嘗試。然而，這些實驗研究用于臨床實踐之前，必須做大量工作，以便證明其療效的確切安全，使其能更好地應(yīng)用于早期ONFH的治療，并能逆轉(zhuǎn)病情達到痊愈，避免患者疾病惡化，最終面臨假體置換的厄運。