促性腺激素對動物卵母細胞體外成熟中的作用研究進展

張雨陽，金 一

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

繁殖性能是雌性動物重要的生產(chǎn)力因素。為了提高動物繁殖率，選取生產(chǎn)性狀優(yōu)良的個體進行卵母細胞體外培養(yǎng)技術(shù)是必然選擇。將卵泡內(nèi)未成熟卵母細胞取出，在體外特殊條件下進行培養(yǎng)，獲得成熟卵子完成體外受精的過程稱為卵母細胞體外成熟。一般來說，為了更好地模擬卵母細胞體內(nèi)成熟的環(huán)境并處理好各個成分之間的關(guān)系，必須要向培養(yǎng)體系中添加激素。激素是卵母細胞核成熟的最重要調(diào)節(jié)因子，特別是促性腺激素是哺乳動物體外培養(yǎng)核成熟的主要調(diào)節(jié)器。促性腺激素包括促甲狀腺激素（FSH）和促黃體素（LH），其在卵泡成熟過程中起重要作用，在體內(nèi)調(diào)節(jié)卵泡的正常發(fā)育和誘導(dǎo)排卵，但在體外培養(yǎng)過程中仍有些機制尚不明確。本文主要綜述促性腺激素在卵母細胞體外培養(yǎng)中的作用和在減數(shù)分裂過程中的影響，為哺乳動物繁殖育種提供理論依據(jù)。

1 卵母細胞體外成熟技術(shù)

卵母細胞體外成熟技術(shù)的生物學(xué)定義是將未成熟的GⅤ期卵母細胞從竇卵泡中取出并在適當?shù)呐囵B(yǎng)體系中培養(yǎng), 使其可以在體外成熟到MⅡ期。現(xiàn)階段關(guān)于體外成熟與體內(nèi)成熟之間的研究成果顯示，體內(nèi)成熟卵母細胞與體外成熟卵母細胞發(fā)育的胚胎形態(tài)動力學(xué)沒有顯著差異，表明體內(nèi)成熟卵母細胞與體外成熟卵母細胞的胚胎發(fā)育潛能可能沒有差異[1]。體內(nèi)和體外成熟卵母細胞的透明帶雙折射和減數(shù)分裂紡錘體差異不顯著[2]。此外，體內(nèi)和體外成熟的卵母細胞顯示正常的卵漿，細胞器分布均勻[3]。線粒體形態(tài)在成熟條件之間表現(xiàn)出相似性。在體內(nèi)和體外成熟的卵母細胞中，皮質(zhì)顆粒通常分層成一排，大部分連續(xù)排列在卵漿下方。有人提出預(yù)先培養(yǎng)未成熟卵母細胞，使其保持在減數(shù)分裂停滯狀態(tài)，可以改善細胞質(zhì)成熟，從而提高體外成熟卵母細胞的最終發(fā)育能力[4]。因此，研究促性腺激素在卵母細胞減數(shù)分裂過程中的作用，能為卵母細胞體外培養(yǎng)改善細胞質(zhì)提高卵母發(fā)育能力提供理論依據(jù)。

2 促性腺激素在卵母細胞體外成熟過程中作用

2.1 促卵泡素

促卵泡素（FSH）是決定卵泡在培養(yǎng)中存活和生長的主要激素。FSH有利于促進卵母細胞的成熟和質(zhì)量，導(dǎo)致更高的胚胎卵裂率和更低的妊娠損失率[5]。理論上，在卵泡或黃體階段開始時使用卵泡刺激素引發(fā)可以增強體內(nèi)未成熟卵母細胞的卵泡發(fā)育和成熟能力[6]。卵母細胞存活率與激素添加量之間存在時間依賴性，培養(yǎng)后期向培養(yǎng)基中添加FSH 會導(dǎo)致活卵泡數(shù)量的減少。在體外培養(yǎng)過程中，卵泡存活率對培養(yǎng)基中FSH 濃度的依賴不明顯，但有實驗數(shù)據(jù)表明，卵泡生長在激素含量高的培養(yǎng)基中更強烈[7]。Kreeger 等在試驗結(jié)果表明，含F(xiàn)SH 10 和25 mU·mL-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡直徑明顯大于含F(xiàn)SH 0 或5 mU·mL-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡直徑，F(xiàn)SH 劑量的增加也增加了乳酸的積累，這表明激活了顆粒細胞代謝。然而，非常高劑量的FSH（50 mU·mL-1）導(dǎo)致卵泡存活率下降，因為代謝產(chǎn)物積累得太快[8]。研究證實，無論卵母細胞數(shù)量多少，隨著FSH 劑量的增加，活產(chǎn)率都顯著降低[9]。

2.2 促黃體生成素

促黃體生成素（LH）在卵泡成熟過程中起重要作用。LH 總是存在于體內(nèi)通過獲得足以使卵泡成熟的濃度來刺激體內(nèi)的卵泡生成[10]。LH 刺激卵泡細胞的雄激素合成[11]。LH 并沒有被認為是培養(yǎng)基的必要成分，但目前正在積極討論其對體外卵泡生長的影響的問題[12]。

LH 峰激活負責(zé)卵丘細胞外基質(zhì)形成和穩(wěn)定的基因，即激活卵母細胞的竇狀卵泡壁區(qū)域。LH 峰導(dǎo)致卵丘細胞中表皮生長因子（EGF）家族基因（Areg、Ereg 和BTC）表達迅速增加。這些配體是完整的膜蛋白，通過胞外裂解從細胞表面釋放出來。然后這些配體與EGF 受體（EGFR）結(jié)合并激活受體。此外，這種結(jié)合導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3 和MAPK1 的激活，也被分別稱為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2（ERK1/2）。ERK1/2可刺激卵母細胞成熟。然而，EGF網(wǎng)絡(luò)和ERK1/2在排卵調(diào)節(jié)、卵母細胞成熟和進一步卵泡黃素化中的具體作用還不夠清楚[13-14]。

LH 對卵泡體外成熟影響的研究表明，在添加LH的培養(yǎng)基中，卵泡存活率明顯高于不添加LH的培養(yǎng)基。在低劑量LH 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡比在高LH 濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡直徑更大[15]。當LH 濃度＞5 U·L-1時，顆粒細胞增殖受到抑制，卵泡發(fā)生閉鎖或黃素化。此外，由于LHCGR mRNA的加速降解，高水平的LH 導(dǎo)致LHCGR 的產(chǎn)量和敏感性下降[16]。促性腺激素刺激引起孕激素受體發(fā)生變化，加速子宮內(nèi)膜的成熟；高水平的FSH 或雌激素可能增加顆粒細胞對LH 的敏感性。這種變化使黃體生成素即使在低LH 水平下也能被誘導(dǎo)。黃體化導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的早期成熟[17]。

3 促性腺激素與卵母細胞減數(shù)分裂的關(guān)系

卵泡生長發(fā)育過程中，F(xiàn)SH 和LH 與顆粒細胞上的受體結(jié)合并激活環(huán)腺苷酸系統(tǒng)（cAMP），cAMP通過誘導(dǎo)卵母細胞pKa依賴性磷酸化細胞周期蛋白依賴性激酶1抑制減數(shù)分裂促進因子的活性而維持減數(shù)分裂停止[18]。FSH 誘導(dǎo)卵丘細胞擴散，暫時性抑制卵母細胞減數(shù)分裂，促進細胞質(zhì)成熟，隨后LH 形成排卵峰，使顆粒細胞中cAMP 的含量上升，卵母細胞中cAMP 含量下降，減數(shù)分裂恢復(fù)，誘導(dǎo)卵母細胞成熟，卵丘細胞數(shù)量增加，卵泡破裂和黃體化[19]。一旦誘導(dǎo)卵母細胞成熟會產(chǎn)生一系列復(fù)雜的分子和結(jié)構(gòu)事件，從減數(shù)分裂和生發(fā)泡破裂的恢復(fù)開始，最終在減數(shù)分裂的第2個中期阻止卵母細胞。

LH在體內(nèi)成熟過程中降低了顆粒細胞中NPPC和NPR2 的含量，繼而導(dǎo)致cGMP 水平下降，引起MPF 活化，恢復(fù)了減數(shù)分裂[20-21]。顆粒cGMP 濃度的降低促進cGMP 通過縫隙連接從卵母細胞和卵丘細胞向外顆粒細胞層擴散，使cGMP 濃度在卵泡內(nèi)均勻降低[22-23]。卵內(nèi)cGMP含量過低從而導(dǎo)致卵母細胞PDE3A活化、cAMP水解、PKA失活和MPF激活使卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)[24]。但在體外培養(yǎng)的小鼠壁顆粒細胞中，LH 不能引起NPPCmRNA 和cGMP含量降低[25]。而FSH 在體外培養(yǎng)卵泡時能起到類似于LH在卵母細胞體內(nèi)成熟中的作用，下調(diào)NPPC含量[26]。也有試驗表明，F(xiàn)SH主要通過E2 及其受體間接促進了顆粒細胞中NPPC 的表達發(fā)揮作用[27]。此外，F(xiàn)SH調(diào)節(jié)卵母細胞的翻譯是通過EGFR[28]。

FSH 和LH 相應(yīng)的受體與相匹配的配子結(jié)合后通過顆粒細胞中的cAMP 通路轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生不一樣的結(jié)果。一種假設(shè)是FSH 受體、LH 受體與其他信號通路耦聯(lián)，導(dǎo)致產(chǎn)生不同結(jié)果，另一種假設(shè)是FSH和LH 刺激顆粒細胞時cAMP 的特性和傳播產(chǎn)生不同作用[29]。因此促性腺激素在cAMP 通路中對卵母細胞減數(shù)分裂的作用機制還需要深入研究。

4 小 結(jié)

卵母細胞體外培養(yǎng)是一項很有前途的技術(shù)，但目前還不能滿足當前生產(chǎn)實驗的需要。選擇獲得體外成熟卵母細胞所需的最佳卵泡培養(yǎng)條件需要一個復(fù)雜的方法，需要考慮細胞的機械和化學(xué)環(huán)境、新陳代謝和旁分泌相互作用[30-31]。為了獲得更多的成熟卵母細胞，需要用對卵泡正常生長和發(fā)育至關(guān)重要的因素（包括促性腺激素）進行研究。在大多數(shù)研究中，F(xiàn)SH 是在整個培養(yǎng)過程中添加到培養(yǎng)基中的，而具有LH 活性的藥物僅在培養(yǎng)結(jié)束時添加。在少數(shù)的幾項研究中，為了要保持卵泡的正常生長和發(fā)育，研究人員不僅在培養(yǎng)結(jié)束時向培養(yǎng)基中添加LH 以刺激排卵，還在非常早期階段添加了LH。因此，正確應(yīng)用促性腺激素可以在體外模擬體內(nèi)條件。研究促性腺激素對卵母細胞減數(shù)分裂停滯的維持作用對卵泡生長和發(fā)育的影響仍然是許多研究人員面臨的主要問題。