低氧環境下人乳腺癌細胞系MCF-7轉錄調節因子-1表達變化及其機制

劉穎，喬如麗，尚里，張鋒軍，焦揚馳，胡思暢，趙慶麗

中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院，蘭州 730050

乳腺癌是女性中發病率和病死率都最高的一種惡性腫瘤，嚴重威脅女性身心健康[1]。癌癥是多種內外因素不協調相互作用導致的結果，其中低氧微環境既可促進癌癥的發展，也是癌細胞增殖過程中導致的結果之一[2]。轉錄調節因子(Ets)家族可編碼一大類轉錄因子，這些轉錄因子共享一個高度保守由85個氨基酸組成的DNA結合域(Ets結構域)。Ets家族轉錄因子可調控多種參與癌癥發生和進展的基因表達[3]。多項研究[4,5]證實，Ets家族成員E26轉錄特異性序列-1(Ets-1)在乳腺癌等惡性腫瘤中呈高表達，其可通過增強癌細胞的侵襲性、上皮間質轉化(EMT)以及抗藥性等特性促進癌癥的發展。目前，已確定的Ets的下游目的基因包括參與癌細胞侵襲和轉移的基質降解蛋白酶，如尿激酶和MMP-1、MMP-3、MMP-9等，均已在包括乳腺癌的多種癌癥中反復得到驗證[6～8]。在二級浸潤性乳腺導管癌中，癌組織Ets表達明顯高于癌旁組織。低氧微環境是乳腺癌的重要特點，低氧環境誘導Ets-1和Ets-2在MCF-7、SKBR3、BT20、BT474、MDAMB468等多種乳腺癌細胞系中呈高表達[9,10]。文獻[9,11]報道，低氧環境與Ets-2在MCF-7乳腺癌細胞、多囊卵巢綜合征中的表達相關聯。但是目前關于Ets-1在乳腺癌組織中呈現高水平的機制尚不明確。2018年10月～2019年12月，我們觀察了低氧環境下人乳腺癌細胞系MCF-7 Ets-1表達變化，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器 人乳腺癌細胞系MCF-7(Gibco公司)；DMEM-高糖培養基和胎牛血清(FBS)購自Life科技公司，青霉素以及鏈霉素(雙抗)、胰蛋白酶購自Hyclone公司，RIPA裂解液購自北京索萊寶科技公司，Triton-100購自北京益利精細化學品公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購自Sigma公司，蛋白酶體抑制劑MG132、p300和抑制劑C646均購自美國Selleck公司，ECL化學發光試劑盒購自Thermo Fisher公司。缺氧小室購自Stemcell公司，垂直電泳儀和電轉儀(TRANS-BlotR SD)購自美國BIO-Rad公司，低溫離心機(EPENDORF centrifuge 5417R)購自德國EPendorf公司，蛋白凝膠成像系統購自BIO-RAD公司，實時熒光定量PCR儀(RT-PCR 7500)購自美國ABI公司。

1.2 低氧環境下MCF-7細胞Ets-1蛋白檢測 人乳腺癌細胞系MCF-7培養于含10%FBS以及1%雙抗的DMEM培養基，常氧培養條件為37 ℃、5%CO2、20%O2。本研究用兩種方法創造低氧環境，即CoCl2誘導的化學性低氧培養環境和厭氧培養箱物理性低氧培養環境。①CoCl2誘導的化學性低氧培養環境：取常氧培養條件下生長良好的對數期MCF-7細胞，分成4組，同時分別放入用0、100、200、400 μmol/L的氯化鈷(CoCl2)化學誘導的低氧環境中培養24 h(分別計為0、100、200、400 μmol/L CoCl2組)。采用Western blot法檢測Ets-1蛋白：取生長密度至80%左右MCF-7細胞，用胰酶消化各組細胞，PBS清洗兩遍。使用200 μL的RIPA裂解液提取蛋白，冰上裂解30 min。使用4 ℃離心機，以13 000 r/min離心15 min，小心收集上清。使用BCA法測量蛋白濃度。根據目的蛋白分子量大小配制適宜濃度的SDS-PAGE7.5%分離膠。濃縮膠中以80 V電壓，分離膠中以120 V電壓進行電泳；使用PVDF膜并預活化30 min，0.3A轉膜2.5 h，不同分子量大小的大白適當縮短或延長轉膜時間；室溫下，根據抗體說明書，用5%的脫脂牛奶或5%BSA封閉1 h；加入一抗(各抗體使用濃度見表1)4 ℃孵育過夜；次日，在搖床上使用TBST洗滌10 min，3次；加入相應二抗，室溫孵育1 h；再次使用TBST洗滌10 min，3次；采用lab image軟件分析各組蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。②厭氧培養箱給予的低氧培養環境：取生長良好的對數期MCF-7細胞，將細胞分別置于缺氧小室和常氧小室(分別計為缺氧1組和常氧1組)，維持在37 ℃、5%CO2、1%O2或20%O2、94%N2的培養條件，培養24 h。后采用Western blot法檢測Ets-1蛋白，具體步驟參照“①”。所有細胞在培養過程中，每48 h根據細胞生長狀況更換一次培養基。

1.3 低氧和常氧環境下MCF-7細胞Ets-1 mRNA檢測 采用熒光定量PCR(q-PCR)檢測。取正常條件下培養的對數期MCF-7細胞，分別放入1%O2和20%O2的環境中培養(分別計為缺氧2組和常氧2組)，其他條件都相同并適合細胞的生長。培養24 h后用TRIzol法分別提取細胞總RNA。使用5×All-In-One RT MaterMix(APlied Biological Materials)反轉錄合成cDNA，cDNA可儲存于-20 ℃，或直接進行后續實驗。使用SYBRGreen實時定量PCR試劑盒(Thermo Scientific)完成定量PCR反應，每個反應設置三個副孔。q-PCR以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT表示目的基因的相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

1.4 低氧和常氧環境下MCF-7細胞過表達或敲降HIF-1α基因后Ets-1蛋白檢測 取對數生長期MCF-7細胞，以每孔2×105個接種于兩塊6孔板中，放置于5%CO2、37 ℃恒溫箱中培養，待細胞密度接近60%時分為兩組，正常氧氣量培養組在20%O2正常氧氣量環境下培養，低氧氣量培養組在1%O2低氧氣量環境下培養。正常氧氣量培養組又分為3組，轉染His-HIF-1α過表達組轉染過表達His-HIF-1α，蛋白酶抑制劑MG132組加入蛋白酶抑制劑MG132，對照組不予處理；低氧氣量培養組又分為3組，轉染HIF-1α-siRNA敲降組轉染HIF-1α-siRNA，p300抑制劑C646組加入p300抑制劑，對照組不予處理。其中轉染His-HIF-1α過表達組和轉染HIF-1α-siRNA空載組均采用慢病毒轉染，轉染48 h后更換新鮮培養基，以上兩組均加入2 μg/mL的puro，篩選具有抗性的細胞。取上面6組中的細胞，采用Western blot法檢測Ets-1蛋白，從總體上了解過表達或敲降HIF-1α基因及加入相關抑制劑MG132和C646對Ets-1蛋白表達的影響，初步探索影響Ets-1的機制。方法參照 “1.2的①”。

1.5 低氧和常氧環境下MCF-7細胞Ace-K、p300、COP-1、His-tag、p-S/T蛋白檢測 ①COP-1蛋白：取正常條件下培養的MCF-7細胞，分兩組，分別放入低氧(1%O2)和常氧(20%O2)的環境中培養。用IgG做陰性對照。培養24 h后去除培養基，采用預冷的PBS清洗兩遍并收集細胞。在收集的細胞中加入IP buffer[50 mmol/L Tris，1%Triton X-100，10%(v/v)甘油，150 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，1%蛋白酶抑制劑，10 mmol/L EDTA，pH 7.5]，冰上裂解30 min。4 ℃，以13 000 r/min速度離心10 min，收集上清，加入適量免疫磁珠和相應的IP抗體(處理組：Ets-1抗體和E3泛素連接酶COP-1抗體)或等量同種IgG抗體(陰性對照)，4 ℃翻轉孵育過夜。次日，將抗體-抗原-磁珠復合物進行磁性分離，使用Wash buffer(50 mmol/L Tris，1%Triton X-100，150 mmol/L NaCl)洗滌3次，加入適量上樣緩沖，液煮沸5 min，收集樣品，-80 ℃ 保存或直接進行后續研究。用Western blot檢測蛋白共沉淀情況。②Ace-K蛋白：Ace-K蛋白是乙酰化的重要蛋白，檢測Ace-K蛋白與Ets-1蛋白的共沉淀作用能證明Ets-1是否發生乙酰化。取正常條件下培養的MCF-7細胞，分兩組，分別放入低氧(1%O2)和常氧(20%O2)環境中培養。用IgG做陰性對照。具體步驟參照“1.5的①”。③p300蛋白和p-S/T蛋白：取在低氧(1%O2)條件下培養的MCF-7細胞，用轉染Vector并用IgG做試驗的陰性對照，試驗分為兩組，一組為轉染His-HIF-1α過表達序列和脂質體LipofectamineTM3000，一組為轉入Vector陰性對照序列和脂質體LipofectamineTM3000的陰性對照組。用組氨酸標簽(His-tag)做為純化標記，采用“1.5的①”共沉淀試驗檢測以上3組的p-300蛋白。④COP-1、Ets-1蛋白：取低氧(1%O2)條件下培養的MCF-7細胞，加入DMSO并用IgG做試驗的陰性對照，試驗分為兩組，一組加入DMSO做陰性對照，一組加入用DMSO配置的C646溶液，培養24 h后進行IP試驗。具體步驟參照“1.5的①”。

1.6 低氧環境下MCF-7細胞Ets-1、p-300蛋白檢測 采用細胞免疫熒光染色檢測。取低氧環境下培養了24 h的MCF-7細胞，用胰蛋白酶消化細胞并制備單細胞懸液，密度為5×104/mL，將無菌爬片放置于24孔板中，加入細胞懸液。細胞貼壁后進行免疫熒光染色。首先使用干凈預冷的PBS洗3次，加入4%的多聚甲醛室溫固定20min，然后置于搖床上用PBS清洗3次，每次3 min。滴加0.3%Triton穿孔處理20 min，再次用PBS清洗3次。1%BSA封閉1h后，滴加一抗，孵育過夜。次日，用PBS清洗3次，加二抗，室溫孵育1h，注意避光。然后，PBS清洗3次，用DAPI染色5 min，PBS徹底清洗3次，10 min/次。最后，用防熒光猝滅劑封片。干燥，避光4 ℃保存。待玻片干燥，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 低氧環境下MCF-7細胞Ets-1蛋白相對表達量比較 0、100、200、400 μmol/L CoCl2組Ets-1蛋白相對表達量分別是0.87、1.15、1.43、1.62，后3組與第1組比較，P均<0.05。常氧1組和缺氧1組Ets-1蛋白相對表達量分別是0.11、0.74，兩組比較，P<0.05。

2.2 低氧和常氧環境下MCF-7細胞Ets-1 mRNA相對表達量比較 低氧2組及常氧2組Ets-1 mRNA相對表達量分別為0.002 7、0.001 8，兩組比較，P<0.05。

2.3 低氧和常氧環境下MCF-7細胞過表達或敲降HIF-1α基因后Ets-1蛋白相對表達量比較 常氧條件下，對照組、轉染His-HIF-1α過表達HIF-1α組、加入MG132組的Ets-1蛋白相對表達量分別是0.14、0.81和0.84，過表達HIF-1α組、加入MG132組分別與對照組比較，P均<0.05。在低氧環境下，對照組、siRNA敲降HIF-1α組、加入C646組的Ets-1蛋白相對表達量分別為0.86、0.83、0.86，兩兩比較，P均>0.05。

2.4 低氧和常氧環境下MCF-7細胞Ace-K、p300、COP-1、His-tag、p-S/T蛋白相對表達量比較 ①Co-IP試驗檢測了常氧條件(20%O2)和低氧環境(1%O2)刺激下，Ets-1與E3泛素連接酶COP-1的相互作用，結果顯示低氧環境干擾了Ets-1的降解途徑，Ets-1與COP-1存在共沉淀現象，并且低氧環境影響了共沉淀情況。②乙酰化分析結果顯示，低氧引起的Ets-1乙酰化水平升高并干擾Ets-1的泛素化修飾。低氧刺激(1%O2)下MCF-7細胞Ets-1乙酰化水平高于常氧(20%O2)條件下的Ets-1。常氧組和低氧組都發生了Ets-1與Ace-K共沉淀的現象，20%O2組的Ets-1的表達水平相較于1%O2組有明顯升高。乙酰化的Ets-1蛋白泛素化降解可能受到競爭性抑制，進而影響低氧環境下Ets-1的表達水平。③低氧環境通過p300增強乳腺癌細胞中Ets-1的乙酰化水平。過表達HIF-1α時，乙酰基轉移酶p300蛋白水平相對于vector陰性對照組無顯著改變，但其磷酸化水平顯著升高，p-S/T的表達水平相對于vector組顯著升高，提示了乙酰基轉移酶活性增強。④使用p300抑制劑C646處理生存于低氧環境的MCF-7細胞，Ets-1蛋白表達相較于DMSO對照組無明顯變化，但Ets-1與COP-1互作相對加強，共沉淀效果加強，說明二者相互作用增強依賴于p300活性的減弱。而C646作用后的MCF-7細胞中Ets-1的表達水平相對于DMSO對照組顯著降低。因此，低氧環境通過活化的P300蛋白調節Ets-1的乙酰化的水平影響Ets-1的泛素化降解。

2.5 低氧環境下MCF-7細胞Ets-1、p-300蛋白免疫熒光染色結果 低氧環境(1%O2)下p300蛋白和Ets-1蛋白在MCF-7細胞質中發生了共表達和共定位。

3 討論

乳腺癌嚴重威脅女性健康，以每年17 000 000新發病例的速度在增長[12,13]。近年來，雖然乳腺癌患者可以選擇多種新的治療方案，但伴有腫瘤細胞轉移的患者平均生存率僅為2 %。有研究預測發展中國家未來20年內乳腺癌發病率和病死率將增加55%、58%[14]。低氧環境是腫瘤的重要特征，25%～40%的侵襲性乳腺癌展現出低氧區域。采用polarographic electrodes策略檢測發現，正常乳腺組織平均氧分壓為(14.1±0.3) mmHg，而腫瘤組織中氧分壓僅為(10.3±0.4) mmHg[15,16]。研究[9,10]表明，Ets轉錄因子在乳腺癌細胞系中高表達，且與乳腺癌的侵襲和轉移密切相關。但是，Ets在乳腺癌中的高表達的機制及與低氧微環境的關系尚不清楚。

Ets轉錄因子超家族是細胞內最重要的轉錄調節因子之一，其受多種細胞外刺激和信號通路的調節，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)。在胚胎發育過程中，MAPK通過招募共激活因子CREB和p300磷酸化Ets-1、Ets-2，該過程在正常發育和腫瘤發生等生理過程中發揮重要作用[17]。研究[18]表明，在多種惡性腫瘤的進展過程中，Ets家族蛋白異常高表達，提示該家族轉錄因子在癌癥發展中起重要作用。同時癌細胞增殖過程中，隨著細胞的增多，營養物質相對減少，氧消耗量也顯著增多，造成缺氧的腫瘤微環境，癌細胞可通過激活相關的信號通路，促進癌基因表達，發展出適應低氧微環境的機制。研究[18]發現，HIF可促進腫瘤血管內皮生長因子 (VEGF)和促紅細胞生成素基因的表達。在腫瘤發展進程中，除了經典的目的基因之外，Ets-1也可通過調控VEGF受體和血管生成素2的表達而促進癌組織中血管的生成[19,20]。HIF與Ets-1之間可能存在相互調控關系。Oikawa等在膀胱癌T24細胞系中研究發現，位于Ets-1啟動子上游-424到-279 bp序列為低氧應答元件樣序列(HRE)，在低氧環境下，HIF-1α可以與之結合并促進Ets-1的表達[21]。以上研究結果提示我們，Ets-1的表達水平有可能受HIF-1α調控。而且，HIF-1α是低氧環境下重要的細胞因子，其在乳腺癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織，暗示低氧環境HIF-1α可能調節乳腺癌細胞中Ets-1的高表達。

本研究旨在探究乳腺癌細胞系中低氧微環境調節Ets-1高表達的分子機制。通過q-PCR實驗，我們證實了在乳腺癌細胞中低氧刺激可促進Ets-1 mRNA水平的表達，即低氧環境增加了Ets-1蛋白的來源。這與Oikawa等在膀胱癌細胞系中的研究結果一致。為了盡可能全面的闡釋低氧微環境導致Ets-1蛋白在乳腺癌細胞系中升高的機制，我們從Ets-1蛋白降解的角度進行了研究。Ets-1蛋白經泛素-蛋白酶體途徑降解。Ets-1可在賴氨酸(Lysine,K)位點上接受多修飾系統直接被調控，如小泛素樣修飾(SUMO)系統，COP-1介導的K-48多聚泛素鏈修飾，以及乙酰化修飾等。而且，不同的翻譯后修飾相互競爭，形成一種高效且可逆的調節方式，無需冗雜的蛋白從頭合成，使細胞能夠對外界環境作出迅速靈敏的反應[22]。SUMO修飾往往不改變Ets-1蛋白穩定性，更多是在其轉錄活性方面起調節作用[12]。因此我們推斷，低氧刺激下，Ets-1乙酰化水平升高，阻礙了COP-1的識別，進而導致蛋白在細胞質積聚。乙酰化分析驗證了這一推斷，在低氧培養條件下，Ets-1乙酰化水平顯著升高，并且Ets-1與COP-1互作也被削弱。

p300是真核生物中最重要的乙酰基轉移酶之一，其活性接受磷酸化/去磷酸化調控[15]。之前研究表明，過表達HIF-1α后，p300磷酸化水平顯著升高。但對HIF-1α調控p300磷酸化的機制，尚未進行深入的探索。有文章報道，低氧環境下，MAPK等信號通路異常活化，ERK/MAPK可使p300磷酸化，酶活性增強，我們推測這可能是有效的分子機制之一。但是，由于p300蛋白分子量偏大，多次Co-IP實驗結果均不理想，因此我們使用細胞免疫熒光染色的方法較直觀得提供了二者在空間上可能互作的信息，但依然缺乏更為精確的證據。隨后，我們使用p300抑制劑C646處理培養于低氧環境中的MCF-7乳腺癌細胞，Ets-1蛋白水平降低，并且Ets-1和COP-1的相互作用顯著增強，這也進一步證實了p300在Ets-1穩定性調節中的重要性。

總之，低氧環境在乳腺癌細胞系中促進Ets-1的轉錄并促進其泛素化降解；機制可能是低氧環境中的HIF-1α引起乙酰基轉移酶p300活性增強，促進Ets-1發生乙酰化，這阻礙了COP-1對Ets-1的識別及后續的泛素化降解，造成Ets-1細胞內水平增加。