DAPT和PI-103對人膠質瘤干細胞侵襲、遷移能力的影響

周星辰，閔敬亮，束漢生，王大巍，程哲，張輝，王昊，楊光

蚌埠醫學院第二附屬醫院,安徽蚌埠 233000

人膠質瘤干細胞(GSCs)是一群具有自我更新、無限增殖、多向分化能力的腫瘤細胞，表達神經干細胞表型CD133，常常集中存在于腫瘤壞死區周邊、微血管周圍以及腫瘤邊緣等膠質瘤常發生侵襲播散的部位。GSCs向遠處的侵襲播散，是惡性膠質瘤復發及無法根治的重要原因[1～3]。我們前期研究[4，5]發現，Notch1信號通路活化的GSCs侵襲遷移能力更強，Notch1信號通路活化后可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路介導調節GSCs的侵襲遷移。馬健會發現，PI3K/Akt/mTOR信號通路能夠反向調控Notch1信號通路的表達。可見，Notch通路與PI3K/Akt/mTOR信號通路具有交互作用，抑制其中1條信號通路無法很好的起到抑制腫瘤細胞侵襲、遷移的作用；在急性淋巴細胞白血病中，單獨應用Notch信號通路抑制劑可導致PI3K/Akt/mTOR信號通路活性增加，使腫瘤細胞對Notch信號通路抑制劑產生耐受，單獨應用PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑也會引起Notch信號通路活化，使腫瘤細胞對PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑產生耐受[6]。聯合應用Notch1信號通路及PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑或許能夠減少GSCs的侵襲遷移能力，達到更好的治療效果，為膠質瘤的治療提供新思路。2020年1～2月，我們觀察了聯合應用Notch1信號通路抑制劑(DAPT)和PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑(PI-103)對GSCs侵襲、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人膠質瘤U87細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。DAPT和PI-103,DMEM、DMEM/F12培養基,B27,表皮生長因子(EGF),堿性成纖維細胞生長因子(bFGF),CD133、nestin、Hes1抗體,pmTOR(Ser2448)抗體,小鼠抗人GAPDH抗體,辣根過氧化物酶標記的山羊二抗。Transwell小室,Matrigel基質膠。

1.2 GSCs的獲取及鑒定 取U87細胞置于干細胞培養基中培養，由DMEM/F12(1∶1)培養基、EGF(20 μg/L)、bFGF(20 μg/L)以及B-27(1∶50)配置。待形成懸浮生長的干細胞球后，使用1.25 g/L胰蛋白酶和2 mmol/L的乙二胺四乙酸常規消化、漂洗細胞。利用CD133免疫磁珠細胞分離試劑盒分離細胞，將收集的CD133+和CD133-的細胞重懸置于無血清干細胞培養基中進行培養。培養條件為室溫37 ℃、飽和濕度、5%CO2。取培養獲得的第3代細胞球，免疫熒光染色后免疫熒光激光共聚焦顯微鏡下觀察到，獲得細胞球中神經干細胞標志物CD133與nestin陽性表達，說明GSCs分選成功。

1.3 GSCs分組、DAPT和PI-103處理方法 取GSCs細胞，分為DAPT處理組(A組)、PI-103處理組(B組)、DAPT和PI-103 共同處理組(C組)、藥物溶媒對照組(D組),A組加入20 μmol/L的DAPT培養，B組加入4 μmol/L的PI-103培養，C組加入20 μmol/L的DAPT+4 μmol/L的PI-103共培養，對照組不作任何處理。

1.4 各組細胞Notch1活化標志物(HES1、pmTOR蛋白)檢測 采用Western blotting法。在干細胞培養基中懸浮培養各組細胞,成熟后收集各組細胞，提取總蛋白，-80 ℃保存。取各處理組的總蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴下以80V電壓轉至醋酸纖維素膜(PVDF膜)，時間為90 min。PBST緩沖液洗膜3次，脫脂奶粉封閉2 h。剪膜后加入不同一抗后4 ℃孵育過夜，兔抗人Notch1抗體、兔抗人HES1抗體、兔抗人Akt抗體、兔抗人pAkt抗體、兔抗人mTOR抗體以及兔抗人pmTOR抗體的稀釋比例均為1∶1 000。次日復溫清洗后加入對應二抗室溫孵育1 h。使用凝膠成像分析系統采集條帶結果，使用Image J軟件對條帶進行量化分析，分析特異性條帶的光密度值，作為目的蛋白相對表達量。

1.5 各組細胞侵襲、遷移能力觀察 采用Transwell侵襲實驗。將Transwell小室加在24孔板上，取60 μL matrigel膠均勻鋪在小室上室，37 ℃溫箱內預置60 min。上室每孔加100 μL約含有2×104個細胞的無血清細胞懸液，下室中加500 μL的10%胎牛血清的DMEM。放入培養箱培養12 h后，將小室取出，棄掉上室內的培養基，4%多聚甲醛固定5 min，結晶紫染色后，隨機選擇5個視野，100倍倒置顯微鏡下觀察并拍照，計算穿過膜的細胞數。Transwell遷移實驗不鋪matrigel膠，其余同Transwell侵襲實驗。均重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組Hes1、pmTOR蛋白相對表達量比較 A、B、C、D組Hes1蛋白相對表達量分別為0.77±0.07、0.41±0.04、0.40±0.03、0.78±0.06，pmTOR蛋白相對表達量分別為0.31±0.02、0.33±0.02、0.19±0.01、0.62±0.05;與D組和A處理組相比，B、C組Hes1的蛋白相對表達量降低(P均<0.01)；與D組相比，A、B、C組pmTOR蛋白相對表達量降低(P均<0.05)；與A、B組比較，C組pmTOR蛋白相對表達量降低(P均<0.05)。

2.2 各組侵襲、遷移穿膜細胞數比較 A、B、C、D組侵襲穿膜細胞數分別22.35±6.75、26.87±6.91、8.21±3.53、61.63±10.87，A、B、C、D組遷移穿膜細胞數分別為23.18±6.56、25.09±6.73、8.78±3.67、63.25±11.03;與D組相比，A、B、C組侵襲、遷移穿膜細胞數降低(P均<0.05)；與A、B組比較，C組侵襲、遷移穿膜細胞數降低(P均<0.05)。

3 討論

Notch信號通路在人腦腫瘤中處于異常激活狀態，起著維持GSCs的自我更新、促進其增殖、抑制其分化的作用[7，8]。PI3K/Akt/mTOR信號通路在膠質母細胞瘤和GSCs中亦處于高度激活狀態，是調節腫瘤細胞侵襲遷移的重要信號通路[9，10]。前期我們通過對Notch1信號通路進行研究發現，隨膠質瘤惡性級別升高，Notch1活化標志物Hes1表達也隨之升高；在GSCs中Notch1信號通路處于高度活化狀態，且使用DAPT抑制Notch1通路活性后，PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性降低，膠質瘤干細胞的侵襲遷移能力下降[4，5]，表明Notch1通路經PI3K/Akt/mTOR信號通路調解膠質瘤干細胞的侵襲遷移。但Notch通路與PI3K/Akt/mTOR信號通路具有交互作用，單一的抑制其中一條信號通路無法很好的起到抑制腫瘤細胞侵襲、遷移的作用；因此，聯合應用兩種通路抑制劑或許能夠達到降低GSCs侵襲遷移能力的目的，取得更好的治療效果，為惡性膠質瘤的治療提供新思路。

本實驗通過免疫磁珠分選法在U87膠質瘤細胞系中分離出CD133+表達的細胞，在體外對其進行培養，成功獲得可連續傳代的GSCs。本研究將GSCs分為4組， DAPT為γ分泌酶抑制劑，能夠有效的抑制Notch1信號通路的活化，為Notch1通路特異性抑制劑[11,12]，PI-103為P13K/mTOR雙靶點小分子抑制劑，可以特異性抑制P13K 和mTOR活性，且不會因信號反饋而使Akt激活，其抑制效果明顯優于其它抑制劑[13，14]。本研究發現，A組Hes1相對表達量明顯降低，表明Notch1信號通路得到有效的抑制;B組的pmTOR相對表達量明顯降低，表明PI3K/Akt/mTOR信號通路得到有效的抑制;C組Hes1和pmTOR蛋白表達明顯降低，表明Notch1信號通路和PI3K/Akt/mTOR信號通路均得到有效的抑制；C組pmTOR蛋白表達明顯低于A、B組，結合我們前期研究Notch1信號通路經PI3K/Akt/mTOR信號通路調節GSCs的侵襲遷移能力，推測通過聯合抑制Notch1信號通路和PI3K/Akt/mTOR信號通路可以進一步降低GSCs的侵襲遷移能力。本研究還發現,與D組相比，A、B、C組的遷移和侵襲能力下降，表明通過分別抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路、Notch1信號通路、聯合抑制Notch1信號通路和PI3K/Akt/mTOR信號通路均可以使GSCs的侵襲、遷移能力降低；其中A、B組穿過小室聚碳酸酯膜的平均每個視野細胞數目明顯高于C組，表明通過聯合抑制Notch1信號通路和PI3K/Akt/mTOR信號通路使GSCs的侵襲遷移能力進一步下降。

總之，聯合抑制Notch1信號通路和PI3K/Akt/mTOR信號通路能夠顯著降低GSCs侵襲、遷移能力。