肺癌患者血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因的檢測分析

唐華，廖洪春，岑玉蘭，廖光付，唐際富

1廣西科技大學第二附屬醫院，廣西柳州 545006；2廣西壯族自治區龍潭醫院；3廣西壯族自治區胸科醫院

肺癌是常見的呼吸系統惡性腫瘤，也是全球范圍內癌癥死亡的首要原因，嚴重威脅人類健康[1]。肺癌的治療包括手術治療、化療及分子靶向治療等，但晚期肺癌患者預后較差[2]。腫瘤的發生與原癌基因的激活、抑癌基因的失活有關，而腫瘤相關基因的表觀遺傳學修飾如甲基化、乙酰化、糖基化等是調控基因表達的重要機制。研究[3,4]表明，通過檢測患者外周血、支氣管肺泡灌洗液(BALF)及癌組織標本中抑癌基因甲基化情況，有助于肺癌的早期診斷。但支氣管鏡下活檢獲取的癌組織標本可能會因取材位置不當，出現假陰性的結果。BALF雖能大面積沖洗收集脫落的腫瘤細胞，但仍需支氣管鏡下操作，具有一定的創傷性。而血漿標本容易獲取，檢測血漿標本中游離DNA的異常改變，具有較高的臨床價值。矮小同源盒基因2(SHOX2)基因位于3q25.32，是同源盒基因家族的成員，編碼蛋白包含DNA結合域，作為轉錄調節因子調控基因表達，影響組織器官的生長發育及分化。SHOX2基因是雙向調控基因，在特定組織類型中發揮抑癌基因的作用，其甲基化沉默與肺癌關系密切，甲基化SHOX2基因檢測有望成為肺癌早期篩查的指標[5]。RAS相關區域家族1A(RASSF1A)基因位于3p21.31，是典型的抑癌基因，其CpG島啟動子區域的高甲基化失活參與肺癌、結直腸癌等多種癌癥的發生發展，檢測甲基化RASSF1A基因有可能成為肺癌的診斷治療新靶點[6]。本研究檢測了肺癌患者甲基化SHOX2、RASSF1A基因，并探討其意義。

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1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月～2019年1月廣西科技大學第二附屬醫院收治的肺癌患者92例(觀察組)，男60例，女32例；年齡42～76(53.2±6.7)歲；病理類型：肺腺癌37例，肺鱗癌33例，小細胞肺癌22例；腫瘤分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期33例，Ⅲ期25例，Ⅳ期13例。腫瘤分化程度：高分化21例，中分化36例，低分化35例；伴淋巴結轉移40例，無淋巴結轉移52例。納入標準：①經病理學檢查明確診斷為肺癌；②均為初次診治，既往未接受過任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整。排除標準：①同時合并有感染性疾病，如呼吸系統感染等；②伴其他器官系統惡性腫瘤；③合并嚴重的心肺肝腎等臟器功能障礙。另選68例肺部良性疾病患者作對照(對照組)，男41例，女27例；年齡43～78(54.6±6.1)歲；疾病類型：肺結核30例，肺炎性假瘤23例，間質性肺病8例，肺結節病7例。患者及家屬均知情同意并簽字，且本研究經我院倫理委員會審核批準通過。

1.2 血漿、BALF、癌組織甲基化SHOX2和RASSF1A基因檢測 采用甲基化特異PCR法。①血漿中甲基化SHOX2、RASSF1A基因檢測：所有入選對象入院后術前清晨抽取空腹靜脈血約10 mL，2 h以內以5 000 r/min的速度離心10 min，離心半徑10 cm，吸取上層血漿，-80 ℃條件下保存待測。采用游離DNA提取試劑盒提取血漿中DNA。DNA的OD260/OD280比值一般為1.7～1.9。應用亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA，實驗步驟嚴格按照EZ DNA Methylation-Gold Kit說明書進行，將DNA中尚未甲基化的胞嘧啶(C)修飾為尿嘧啶(U)，50 ℃條件下水浴過夜，乙醇沉淀，DEPC水重懸后進行甲基化特異PCR。MS-PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸8 min，共40個循環。總反應體系50 μL，DNA模板10 μL，緩沖液2.5 μL，Taq酶2 U，dNTPs 4 μL，MgCl 4 μL，上游及下游引物各1 μL，PCR結束后瓊脂糖凝膠電泳，以去離子水為陰性對照，應用紫外成像分析系統照相。應用Image J軟件對甲基化及非甲基化條帶的灰度值進行統計，計算甲基化條帶/非甲基化條帶灰度值比值。根據DNA條帶判斷結果，甲基化陽性：甲基化引物擴增出目的條帶，而非甲基化引物未擴增出目的條帶。甲基化陰性：非甲基化引物擴增出目的條帶，甲基化引物未擴增出目的條帶。②BALF中甲基化SHOX2、RASSF1A基因檢測：所有入選對象入院后均接受纖維支氣管鏡檢查，采取BALF，首先向要灌洗的肺段注入2%利多卡因1 mL進行局部麻醉，然后經活檢孔向病變肺段注入50 mL生理鹽水(NS)，負壓吸引回收至瓶子中，重復2次，回收量≥40 mL，將濾液置于離心管，以2 000 r/min速度離心10 min，離心半徑10 cm，去上清液，沉淀細胞團用500 μL～1 mL細胞保存液懸浮，轉移至1.5 mL的Eppi管，-80 ℃下保存待測。采用細胞基因組DNA抽提試劑盒抽提BALF細胞DNA，抽提DNA后實驗步驟同“①”。③癌組織中甲基化SHOX2、RASSF1A基因檢測：收集所有入選對象術中新鮮獲取的組織標本，置于凍存管中液氮速凍，轉運置實驗室后-80 ℃條件下保存待測。采用組織基因組DNA抽提試劑盒抽提冰凍新鮮組織中DNA，抽提DNA后實驗步驟同“①”。

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2.4 血漿與癌組織、BALF中甲基化SHOX2、RASSF1A基因的一致性 血漿、癌組織、BALF中甲基化SHOX2基因陽性率分別為52.2%(48/92)、59.8%(55/92)、51.1%(47/92)，甲基化RASSF1A基因陽性率分別為55.4%(51/92)、64.1%(59/92)、53.3%(49/92);血漿中甲基化SHOX2基因陽性率與癌組織、BALF中的結果具有良好的一致性，一致率分別為87.3%(48/55)、97.9%(47/48);血漿甲基化RASSF1A基因陽性率與癌組織、BALF中的結果具有良好的一致性，一致率分別為86.4%(51/59)、96.1%(49/51)。

2 結果

2.1 兩組血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因陽性率比較 觀察組血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因陽性率分別為52.2%(48/92)、55.4%(51/92)，對照組分別為2.9%(2/68)、5.9%(4/68)，兩組比較，P均<0.05。

2.2 血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因與肺癌臨床病理特征的關系 血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因與肺癌臨床病理特征的關系見表1。由表1可知，血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因陽性與肺癌腫瘤分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。

通過專家法確定發生頻度、危害程度、檢測難度和維修難度這4個決策指標對應的決策權，分別為：η1=0.18，η2=0.28，η3=0.28，η4=0.26。

2.3 血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因對肺癌的診斷價值 根據ROC，以約登指數最大時，血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因診斷肺癌的最佳截斷值分別為1.234、1.379。血漿甲基化SHOX2單獨檢測診斷肺癌的靈敏度為53.7%、特異度為86.07%、陽性預測值為87.4%、陰性預測值為16.7%、AUC為0.812、95%CI為0.730～0.882，血漿甲基化RASSF1A基因單獨檢測診斷肺癌的靈敏度為64.1%、特異度為92.1%、陽性預測值為93.7%、陰性預測值為29.8%、AUC為0.748、95%CI為0.671～0.820，兩者聯合檢測診斷肺癌的靈敏度為81.6%、特異度為94.2%、陽性預測值為96.6%、陰性預測值為40.9%、AUC為0.911、95%CI為0.843～0.955。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因對肺癌的診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

3 討論

SHOX2大小約10 kb，又可分為2a、2b及2c三個亞型，在胚胎發育過程中發揮重要調控作用。近年研究發現，腫瘤中SHOX2基因存在異常甲基化的現象，導致基因轉錄水平表達沉默，影響腫瘤細胞的生物學功能，因此甲基化標記可能是腫瘤診斷的重要標志物[10]。RASSF1A是一種重要的抑癌基因，腫瘤中此基因啟動子區CpG島處高甲基化是導致該基因失活的主要機制，引起腫瘤細胞無限增殖且凋亡抑制[11]。本研究顯示，觀察組血漿SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性率高于對照組，表明肺癌患者SHOX2基因的甲基化水平升高，但其機制尚不清楚，可能是結合于基因啟動子區CpG島處的轉錄因子或轉錄輔助因子異常后，導致甲基化位點暴露，CpG甲基化結合蛋白結合到基因啟動子區，促進其甲基化[12]。此外，血漿中甲基化SHOX2、RASSF1A基因陽性與肺癌腫瘤分期、淋巴結轉移有關，表明甲基化SHOX2、RASSF1A基因促進肺癌的發生發展，其原因是RASSF1A基因編碼的蛋白具有結合Ras蛋白的結構域，并發揮抑制Ras信號傳導通路的作用，腫瘤發生時甲基化RASSF1A基因失活，導致腫瘤過度增殖[13]。而SHOX2基因編碼蛋白是一種重要的轉錄抑制因子，甲基化SHOX2基因失活后，下游上皮間質轉換等癌基因表達明顯上調，促進腫瘤細胞的增殖及轉移[14]。

肺癌是最常見惡性腫瘤，發病率為61.86/10萬，也是病死率最高的癌癥，約50.04人/10萬[7]。雖然早期篩查及早期治療有利于預防甚至治愈疾病，但是多數肺癌癥患者發現于中晚期，5年生存率僅17.8%，低于其他大多數癌癥[8]。臨床上可用于早期診斷肺癌的標本包括血漿、BALF及癌組織活檢等，但臨床上相較于其他標本，血漿標本易獲取，對創傷小，患者容易接受，因此檢測血漿標本中腫瘤標志物的表達水平，具有較高的臨床價值。抑癌基因如RB轉錄抑制因子1、磷酸酶和張力蛋白同源物基因等的失活是腫瘤發生的重要原因，抑癌基因的失活涉及多種機制的參與，如基因突變、染色體雜合性丟失等。抑癌基因甲基化是近年來發現的新的調控基因表達的化學修飾方式，是在甲基轉移酶介導下，將胞嘧啶裝變為5-甲基胞嘧啶，甲基化位點多位于基因5′端的CpG島處，而多種腫瘤中均存在基因異常甲基化的現象[9]。因而針對基因甲基化的研究可為臨床診斷、治療腫瘤提供指導。

以往文獻[5,15]報道，SHOX2和RASSF1A基因異常甲基化有助于腫瘤的早期診斷。本研究顯示，單獨檢測血漿甲基化SHOX2和RASSF1A基因診斷肺癌的靈敏度不高，而血漿甲基化SHOX2和RASSF1A基因聯合檢測診斷肺癌的靈敏度增加，表明聯合檢測對肺癌診斷具有較高的價值，有可能成為診斷肺癌的有效輔助工具。有學者報道，如血漿學指標與細胞學檢測結合使用，能夠彌補細胞學檢查中診斷不能明確的情況，診斷肺癌的靈敏度和特異度分別提高至93.0%和94.7%[16,17]。

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臨床上對肺癌檢測的理想目標是通過檢測血液中腫瘤指標觀察腫瘤的發生及發展過程。腫瘤患者血漿DNA主要來自腫瘤組織釋放入血的DNA，近年來隨著基因技術的發展，檢測血漿DNA有助于腫瘤的早期診斷及致病基因的檢出。而BALF是一種非侵入性診斷標本，易通過纖維支氣管鏡檢查獲得，由于其靠近腫瘤細胞，BALF亦可作為檢測腫瘤生物標志物的替代手段。本研究對血漿與BALF、癌組織中甲基化SHOX2和RASSF1A基因檢測結果進行比較，結果顯示血漿與BALF、癌組織中甲基化率具有良好的一致性，表明檢測血漿甲基化SHOX2和RASSF1A基因是一種可靠的檢測方式。

總之，肺癌血漿甲基化SHOX2、RASSF1A基因水平升高，兩指標甲基化陽性與肺癌腫瘤分期、淋巴結轉移有關，聯合檢測兩者有助于提高對肺癌的診斷,血漿中甲基化SHOX2、RASSF1A基因陽性率與癌組織、BALF中的結果具有良好的一致性。