CRISPR/cas9基因編輯技術在羊毛品質改良中的應用

李忠慧

（新疆畜牧科學院生物技術研究所，烏魯木齊 830000）

綿羊作為重要的家畜經濟動物，羊毛是其主要的高附加值產品。羊毛是一種純天然、可再生、可降解的綠色環(huán)保型纖維，具有天然的透氣性及吸收、釋放空氣、濕氣的獨特能力。同時，由于羊毛纖維柔軟有彈性，使得羊毛制品具有保暖性強、穿著輕柔等特點。澳洲美利奴羊毛作為世界上品質最好的羊毛，與其他羊毛相比，更為纖細柔軟，毛色白而有光澤，富有彈性。隨著我國國民經濟的快速發(fā)展和居民收入水平的不斷提高，居民消費能力不斷提升，人們對羊毛等動物纖維服飾產品的需求量不斷增長和對羊毛的質量要求也不斷提高，我國已然成為羊毛生產加工大國和消費大國。但是由于我國的羊毛產量偏低、進口量大，羊毛細度、長度、毛色等品質不高，我國羊毛產業(yè)無法滿足實際生產需求，培育和改良毛用綿羊品種以滿足生產生活需求尤為重要。

在經濟動物的品種培育過程中，現(xiàn)代生物技術手段有助于縮短育種時間、快速提高和改善動物生產性能。基因編輯作為現(xiàn)代生物技術的重要手段之一，是近年基于基因組和基因信息技術發(fā)展起來的通過人工設計實現(xiàn)對特定基因或基因組靶位點進行精準編輯的前沿技術，目前已經成為生物醫(yī)學、農業(yè)動物育種和模式動物等領域的研究熱點。在動物育種領域，由于傳統(tǒng)育種手段的增產潛力已接近極限，利用高效穩(wěn)定的基因編輯技術創(chuàng)新育種手段和提升現(xiàn)代動物育種效率及技術水平，對于育種新材料的創(chuàng)制和品種培育至關重要。

1 羊毛發(fā)育過程及其分子調控

羊毛生長的“發(fā)源地”是毛囊，毛囊作為哺乳動物皮膚重要的微型附屬器官，其組織結構和性狀決定了毛發(fā)的生長和品質。毛囊可分為兩種不同類型，即初級毛囊和次級毛囊，一般認為初級毛囊生長毛，而次級毛囊生長絨。毛囊的發(fā)育可分為誘導期、器官發(fā)生期和細胞分化期三個時期[1]，依次經歷形成毛囊基板、真皮凝集物、真皮乳頭，最終形成完整成熟的毛囊、腺體和肌肉結構[2-3]。毛囊發(fā)育完成后，即進入周期性生長循環(huán)階段，包括生長期（細胞快速增值、毛干快速生長）、退行期（細胞的增殖分化和毛干的生長趨于停滯）和休止期（細胞增殖停滯、毛干脫落）[4-5]。而毛囊的周期性生長發(fā)育過程受到復雜的分子網(wǎng)絡調控。近年來，有關哺乳動物毛囊發(fā)育的調控機制研究已取得較大進展，研究發(fā)現(xiàn)，Hox 基因、BMP 基因、β-連環(huán)蛋白基因、KAP 基因以及Wnt 信號通路、Notch 信號通路、FGF 信號通路等均參與調控毛囊的生長發(fā)育，他們之間構成一個龐大復雜而又精準的基因網(wǎng)絡調控圖譜，每個基因之間緊密聯(lián)系、相互制約，為毛囊發(fā)生及周期性循環(huán)提供必要保障。因此，在現(xiàn)代生物技術快速發(fā)展的時代，利用基因編輯等先進的技術手段研究調控毛發(fā)生長相關的功能基因，可為培育和改良毛用羊品種提供更多的科學支持。

2 CRISPR/cas9基因編輯技術

CRISPR/cas9 技術作為目前最流行的基因編輯技術，是人們從細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的一把可以高效而精準地修改生命藍圖的利刃，是對靶向基因進行特定DNA 修飾的技術。該基因編輯技術系統(tǒng)主要由Cas9 核酸酶和sgRNA 組成。Cas9 核酸酶具有切割雙鏈DNA 的活性結構域，使得雙鏈DNA 斷裂；sgRNA 是由起支架功能的tracrRNA 與特異性的crRNA 結合形成嵌合RNA。CRISPR/cas9 技術就像是一把“生物剪刀”，在sgRNA作用下通過RNADNA 堿基互補配對將Cas9/sgRNA 復合物靶向募集到目的基因，Cas9 再通過識別目的基因上的PAM序列（5'-NGG-3'）定點切割雙鏈DNA，進而對目標基因定向刪除、突變或插入新的基因片段，具有高效、快捷、精準、特異性高等特點。通過這一技術，不僅大大降低對動物進行基因敲除、基因修飾的難度，更是將動物轉基因技術由傳統(tǒng)的隨機整合推向了高度精確的基因組定向刪除、突變或插入，開創(chuàng)了轉基因動物生產的新時代。因此，CRISPR/Cas9 基因編輯技術自出現(xiàn)以來，便快速地應用于綿羊等經濟動物的基因編輯研究。

3 CRISPR/Cas9技術在羊毛品質改良中的應用

運用CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯與羊毛生長性狀相關的功能基因以獲得基因編輯綿羊，該過程一般包括以下幾個步驟：（1）利用sgRNA 在線設計軟件，針對目標基因上的PAM序列（5'-NGG-3'）設計sgRNA，并合成sgRNA 序列；（2）制備合成Cas9 mRNA；（3）利用體外受精等技術獲得受精卵；（4）利用顯微注射技術將sgRNA 和Cas9 mRNA注射入受精卵內，并置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)受精卵；（5）將胚胎移植至受體母羊體內發(fā)育成長；（6）待羔羊出生后檢測基因編輯情況。

已有研究發(fā)現(xiàn)，屬于成纖維細胞生長因子FGFs（一類調節(jié)細胞生長的多功能肽類生長因子）家族成員之一的FGF5基因，被認為在毛發(fā)生長過程中抑制毛發(fā)的生長期，而突變FGF5基因則可導致毛囊生長期延長，促進毛發(fā)生長，從而提高羊毛產量、改善羊毛品質。因此，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)胚胎注射獲得21只FGF5靶向編輯的陜北白絨山羊，對其絨長性狀進行檢測的結果表明，F(xiàn)GF5 基因靶向編輯的絨山羊的絨毛長度和密度等指標顯著高于野生型絨山羊[6]；本課題組運用CRISPR/Cas9技術對中國美利奴細毛羊的FGF5 基因進行編輯，共獲得16 只FGF5 基因功能失活的基因編輯羔羊，其中12只存活超過1年。羊毛性狀檢測結果表明，12 只基因編輯細毛羊的羊毛毛叢自然長度及其伸直長度顯著長于同齡、正常野生型細毛羊，且產毛量顯著高于野生型細毛羊[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，調節(jié)毛囊黑色素細胞合成褐黑素的ASIP 基因拷貝數(shù)或基因表達水平的變化能夠改變細毛羊的毛色，通過CRISPR/Cas9技術編輯ASIP基因獲得了不同顏色和毛色圖案的彩色細毛羊[8]，證明修飾ASIP基因能夠實現(xiàn)毛色的定向改變，是培育彩色細毛羊的一條有效、可行的技術途徑。此外，除了FGF5 基因和ASIP基因，毛纖維性狀相關基因的其他基因，如VEGF、Tβ4、PRL、LCE7A、MOGAT2、MOGAT3等基因均可通過CRISPR/Cas9技術進行精準編輯以制備和選育性狀優(yōu)良的綿羊品種。

4 展 望

傳統(tǒng)的綿羊品種培育主要是通過基于表型選擇的雜交改良等常規(guī)育種技術，雖在一定程度上取得了育種效果，但是這種育種手段周期長、預見性差、選擇效率低，在培育新品種方面難度較大，而且在大動物基因組上實現(xiàn)修飾和改造的成本和技術要求高。CRISPR/Cas9 基因編輯技術自出現(xiàn)以來，其高效、快捷、精準、特異性高的特點大大縮短育種時間，加快育種進程，同時為動物遺傳育種、基因組學研究、疾病防控等方面提供了新的研究思路。但目前對基因編輯技術來說，最重要的還是能夠合理利用和監(jiān)管基因編輯，保障其安全性，推動社會生產。

5 小 結

羊毛細度、長度、毛色等品質的改良，在人類生活中使得人們有更多的機會選擇舒適度更高、加工工藝更多樣的羊毛產品，進一步滿足了人類對高品質生活的追求。因此，利用CRISPR/Cas9 技術對羊毛相關目的基因進行定向精準編輯，將是提高羊毛產量和改善羊毛品質的一種有效的精準分子育種途徑。