福辛普利對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用和機制研究

裴寶靜，李建燕，辛立杰，郭娜，路靜，王洋，王慶海*

(1.滄州市中心醫(yī)院骨二科，河北 滄州 061001；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017)

骨質(zhì)疏松癥是一種系統(tǒng)性骨代謝疾病，其特征主要表現(xiàn)為骨量逐漸減少，骨微結(jié)構(gòu)損傷及骨折風(fēng)險增加等[1]。骨重塑通過成骨細胞調(diào)節(jié)的骨形成和破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收來維持，當骨吸收大于骨形成時，將會導(dǎo)致骨量減少，引起骨質(zhì)疏松癥[2]。腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)的多種生理和病理作用是通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)/血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ/血管緊張素1型受體(angiotensin type-1 receptor，AT1R)信號和ACE-2/Ang(1-7)/Mas級聯(lián)介導(dǎo)的[3]。RAS在骨骼健康、結(jié)構(gòu)以及新陳代謝之間具有重要作用，研究表明RAS相關(guān)成分(如腎素、ACE-1和AngⅡ受體)對局部骨骼重塑過程具有重要作用[4-5]。此外，幾種已知靶向于ACE-2/Ang(1-7)/Mas受體軸介導(dǎo)其作用的藥物包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)和AT1R阻滯劑，可改善骨密度和骨微結(jié)構(gòu)損傷，對骨質(zhì)疏松癥治療具有潛在作用[6]。福辛普利是一種ACEI，但對骨質(zhì)疏松癥的研究較少。因此，本研究探討了福辛普利對卵巢切除術(shù)(ovariectomy，OVX)大鼠模型的治療作用及其對RAS/一氧化氮(nitric oxide，NO)信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級SD雌性大鼠(250 ± 5)g購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、福辛普利(高劑量組10 mg/kg，中劑量組5 mg/kg，低劑量組2.5 mg/kg)組、陽性對照組(卡托普利40 mg/kg)，每組各10只。所有動物實驗均通過動物倫理委員會的同意和批準。

1.2 試劑與儀器 卡托普利片和福辛普利鈉片均購買于中美上海施貴寶制藥有限公司(上海，中國)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphate，TRACP)試劑盒、骨源性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)試劑盒、鈣測試盒、磷測試盒、NO試劑盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(南京，中國)；Anti-AngⅡ抗體購自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Dallas，Texas，美國)，AT1R、ACE-1、AT2R抗體均購自Novus Biologicals(Littleton，Colorado，美國)；Micro-CT掃描儀(SkyScan，Kontich，比利時)。

1.3 方法

1.3.1 OVX大鼠模型建立 采用雙側(cè)卵巢切除法建立大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，造模前大鼠禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，從大鼠背部脊柱兩側(cè)分離并切除雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組僅切除卵巢附近的脂肪組織，術(shù)后縫合傷口。手術(shù)當周為第0周，連續(xù)肌肉注射4 d抗生素(氨芐青霉素，4×104U/d)。

1.3.2 給藥治療 根據(jù)文獻報道給藥治療方法[7]，造模8周后開始灌胃給予福辛普利(10 mg/kg、5 mg/kg和2.5 mg/kg)，陽性對照組灌胃給予卡托普利(40 mg/kg)，模型組和假手術(shù)組均灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥6周，每周測量1次體重。

1.3.3 子宮臟器系數(shù) 大鼠腹主動脈取血，脫頸椎處死，解剖分離大鼠的子宮并稱重，根據(jù)公式計算：子宮臟器系數(shù)=子宮重量(g)÷體重(100 g)。

1.3.4 骨代謝和骨礦化指標檢測 按試劑盒說明書通過標準比色法檢測大鼠血清中TRACP、BALP活性以及鈣(Ca)和無機磷(P)的水平。

1.3.5 股骨Micro-CT掃描 采用Micro-CT掃描儀分析大鼠股骨近端的骨微結(jié)構(gòu)，分辨率為18 μm。掃描系統(tǒng)于350 ms內(nèi)以70 kV、85l A和1 000個/180°投影校準。從橫截面圖像中采用CT Analyzer V 1.11.0.0軟件(SkyScan)提取僅包含松質(zhì)骨的目標體積(volume of interest，VOI)，以進行形態(tài)分析。VOI從生長板的下端開始1 mm，向遠側(cè)延伸110個橫截面(高2 mm)。對于形態(tài)分析，通過3D分析(上述CT分析儀軟件)在松質(zhì)骨的每個VOI上計算的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括骨密度(bone mineral content，BMD)、骨體積分數(shù)(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation/spacing，Tb.Sp)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨表面積組織體積比(bone surface/total volume，BS/TV)。

1.3.6 血清NO和NOS檢測 按試劑盒說明書通過標準比色法檢測大鼠血清中NO和NOS的含量。

1.3.7 蛋白免疫印跡(Western Blot)法 大鼠脫頸椎處死，分離收集實驗大鼠的股骨組織，稱取約30 mg，采用Western Blot檢測大鼠股骨組織中AngⅡ、AT1R、ACE-1、AT2R的蛋白表達水平。根據(jù)制造商說明操作提取組織總蛋白，采用二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)法對蛋白進行定量，加入Loading buffer(4×)100 ℃煮沸5 min，然后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來達到分離蛋白的目的，電泳條件：80 V，30 min；120 V，60 min。采用100 V，90 min將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉60 min，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽吐溫緩沖液(tris-buffered saline with tween，TBST)洗滌5次，5 min/次，用一抗(AngⅡ、AT1R、ACE-1、AT2R及β-Actin，按1︰1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5 min/次，用二抗[辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記山羊抗兔IG，按1︰10 000稀釋]孵育90 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影檢測，Image J分析灰度值，β-Actin用作內(nèi)參對照。

2 結(jié) 果

2.1 福辛普利對OVX大鼠體重和子宮臟器系數(shù)的影響 體重結(jié)果表明：與假手術(shù)組相比，造模后第3周模型組大鼠的體重顯著增加，持續(xù)至實驗結(jié)束；從第8周開始給藥，與模型組相比，灌胃給予福辛普利能夠顯著減小OVX大鼠的體重，并呈時間和劑量依賴性(見圖1a和表1)。

表1 大鼠體重變化結(jié)果

子宮的臟器系數(shù)：假手術(shù)組(4.92±0.54)mg/g，模型組(1.11±0.15)mg/g，低劑量組(2.11±0.13)mg/g，中劑量組(3.15±0.50)mg/g，高劑量組(3.85±0.49)mg/g，陽性對照組(3.70±0.42)mg/g。子宮的臟器系數(shù)結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，模型組大鼠子宮的臟器系數(shù)顯著減小(P<0.05)；與模型組相比，灌胃給予福辛普利呈劑量依賴性增加OVX大鼠子宮的臟器系數(shù)(P<0.05，見圖1b)。上述結(jié)果表明本研究初步建立了OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，并初步表明福辛普利具有潛在的抗骨質(zhì)疏松癥作用。

2.2 福辛普利對OVX大鼠血液中骨代謝和骨礦化的影響 骨代謝檢測結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中TRACP和BALP活性顯著增加，灌胃給予福辛普利呈劑量依賴性顯著減小OVX大鼠血清中TRACP和BALP活性(見圖2a～b)。骨礦化檢測結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中鈣和磷水平顯著降低，灌胃給予福辛普利呈劑量依賴性顯著增加OVX大鼠血清中鈣和磷含量(見圖2c～d)。上述結(jié)果表明福辛普利對OVX大鼠的骨代謝和骨礦化過程具有一定的調(diào)節(jié)作用(見表2)。

a 大鼠的體重變化情況 b 大鼠子宮的臟器系數(shù)

表2 福辛普利對OVX大鼠血液中骨代謝和骨礦化的影響

a 大鼠血清中TRACP活性 b 大鼠血清中BALP活性 c 大鼠血鈣水平 d 大鼠血磷水平

2.3 福辛普利對OVX大鼠股骨近端骨微結(jié)構(gòu)和骨密度的影響 采用Micro-CT分析OVX大鼠股骨近端的骨微結(jié)構(gòu)，并對BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N和BS/TV定量分析。股骨骨微結(jié)構(gòu)圖像表明OVX大鼠在股骨干骺端的所有骨小梁骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)中均表現(xiàn)出顯著變化(見圖3a)。與假手術(shù)組相比，OVX組的骨皮質(zhì)厚度和骨量減少，小梁骨微結(jié)構(gòu)明顯受損。相反，灌胃給予福辛普利可顯著改善骨微結(jié)構(gòu)損傷，并恢復(fù)骨皮質(zhì)厚度和骨量。與模型組相比，福辛普利治療組大鼠的BV/TV、BS/TV、Tb.N、Tb.Th以及BMD顯著增加(見圖3b～g)，這些結(jié)果表明福辛普利能夠改善OVX大鼠骨小梁的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)變化和骨微結(jié)構(gòu)受損(見表3)。

a 大鼠股骨近端的Micro-CT分析圖像

表3 大鼠股骨近端骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)和骨密度值

2.4 福辛普利對OVX大鼠血清中NO和NOS的影響 血清NO和NOS結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中NO和NOS的含量顯著降低；與模型組相比，灌胃給予福辛普利呈劑量依賴性增加OVX大鼠血清中NO和NOS水平(見圖4，表4)，上述結(jié)果表明福辛普利對OVX大鼠血清中NO信號具有調(diào)節(jié)作用。

表4 大鼠血液中NO和NOS含量

a 大鼠血清中NO水平 b 大鼠血清中NOS水平

2.5 福辛普利對OVX大鼠股骨組織中局部性RAS系統(tǒng)相關(guān)分子表達的影響 Western blot結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，模型組大鼠股骨組織中AngⅡ、AT1R和ACE-1的蛋白表達水平顯著上調(diào)，同時AT2R的蛋白表達水平下調(diào)；灌胃給予福辛普利能夠顯著下調(diào)OVX大鼠股骨組織中AngⅡ、AT1R和ACE-1的蛋白表達水平，并上調(diào)AT2R的蛋白表達水平(見圖5，表5)，這些結(jié)果表明福辛普利對股骨組織中局部性RAS系統(tǒng)具有一定的調(diào)節(jié)作用。

表5 大鼠股骨組織中局部性RAS系統(tǒng)相關(guān)分子表達量

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，**P<0.05

3 討 論

RAS是一種內(nèi)分泌系統(tǒng)，主要介導(dǎo)體液和電解質(zhì)平衡以及血壓方面的功能[7]。但越來越多的研究表明RAS在骨骼系統(tǒng)中具有局部作用[4-6]。本研究發(fā)現(xiàn)福辛普利作為一種ACE抑制劑可顯著緩解雌激素缺乏大鼠引起的骨質(zhì)疏松癥并改善骨微結(jié)構(gòu)損傷，對骨質(zhì)疏松癥具有潛在的治療價值。

目前，有許多誘發(fā)骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松癥的實驗動物模型，但OVX大鼠模型是研究骨質(zhì)疏松癥的常見動物模型[8]。OVX大鼠的骨質(zhì)流失與人(尤其是更年期)的骨骼變化相似，因此FDA推薦OVX大鼠作為評價骨質(zhì)疏松癥潛在治療藥物的模型[9]。雌激素缺乏可引起OVX大鼠的體重增加和子宮萎縮，雌激素是負責(zé)性器官如子宮發(fā)育的主要雌性激素，并且雌激素通過激活雌激素受體α(estrogen receptor α，ER-α)調(diào)節(jié)食物需求[10-11]。本研究結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的體重從術(shù)后3周開始顯著增加，并持續(xù)至實驗結(jié)束，同時子宮臟器系數(shù)顯著減小，上述結(jié)果表明本研究初步建立OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，為后續(xù)藥物干預(yù)研究奠定了基礎(chǔ)。更重要的是，本研究實驗結(jié)果表明灌胃給予福辛普利能夠顯著緩解OVX大鼠的體重增加，并增加子宮臟器系數(shù)，這表明福辛普利可能對OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥具有潛在的治療價值。

骨代謝生物標志物是骨代謝的有用指標，是監(jiān)測骨代謝疾病預(yù)后和治療效率的有效工具。BALP由成骨細胞產(chǎn)生，有助于骨骼形成，在骨骼重塑過程中都很重要，研究表明BALP代謝水平在骨質(zhì)流失過程中會增加[12]。TRACP是破骨細胞皺紋邊緣區(qū)域發(fā)現(xiàn)的一種骨吸收酶，其代謝水平在骨質(zhì)流失過程中也會顯著增加[13]。本研究結(jié)果表明OVX大鼠血清中BALP和TRACP活性顯著增加，這與之前文獻描述是一致的，并且本研究結(jié)果也表明灌胃給予福辛普利能夠顯著降低OVX大鼠血清中BALP和TRACP的活性。另外，沉積于骨骼基質(zhì)的礦物質(zhì)占正常骨骼結(jié)構(gòu)的50%～70%，骨礦化過程需要骨骼系統(tǒng)與循環(huán)系統(tǒng)以及腎臟之間共同實現(xiàn)，并受到大量抑制或促進相關(guān)因素的調(diào)控[14]。研究表明包括骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的骨代謝疾病中的礦物質(zhì)濃度發(fā)生了變化，主要是Ca和P的腎臟清除率升高，導(dǎo)致血清濃度下降，最終引起Ca和P骨沉積受到抑制[15]。本研究表明灌胃給予福辛普利能夠增加OVX大鼠血清Ca和P含量。除此之外，骨密度測量和骨微結(jié)構(gòu)分析是骨質(zhì)疏松癥診斷的黃金標準。本研究探究了股骨遠端的微環(huán)境變化，福辛普利治療OVX大鼠可明顯改善骨微結(jié)構(gòu)損傷，這些研究結(jié)果表明福辛普利可能通過影響骨代謝和骨礦化過程對骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生潛在治療作用。

另外，NO是細胞間與細胞內(nèi)的一種氣體信號分子，NO主要由NOS催化L-精氨酸產(chǎn)生。研究表明NO和NOS在骨代謝過程中有著重要的作用，基礎(chǔ)濃度的NO對于破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的增殖及基質(zhì)分泌是至關(guān)重要的[16]。有研究表明OVX大鼠血清中NO和NOS含量顯著降低，能夠促進骨吸收并抑制骨形成，最終導(dǎo)致骨質(zhì)流失并引起骨質(zhì)疏松[17]。本研究結(jié)果表明福辛普利能夠顯著增加OVX大鼠血清中NO和NOS含量。

骨骼局部環(huán)境中RAS相關(guān)的信號肽、酶和受體均有表達，這表明RAS在骨重塑過程中起著至關(guān)重要的作用[18]。本研究中，OVX大鼠股骨組織中經(jīng)典的ACE-1/AngⅡ/AT1R通路的表達顯著上調(diào)，而AT2R表達顯著下調(diào)。福辛普利作為ACE抑制劑能顯著下調(diào)OVX大鼠股骨組織中ACE-1/AngⅡ/AT1R通路的表達，并且上調(diào)AT2R表達。AT2R上調(diào)能夠增加骨量，對骨流式相關(guān)疾病有潛在治療價值[5]。據(jù)報道，ACEI抑制RAS經(jīng)典的ACE-1/AngⅡ/AT1R信號傳導(dǎo)可改善骨骼結(jié)構(gòu)，并且臨床研究表明可使ACEI治療患者的BMD增加，骨折風(fēng)險降低[19]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明福辛普利能夠改善OVX大鼠的體重增加和子宮萎縮，并改善骨代謝、骨礦化過程以及骨微結(jié)構(gòu)損傷。更重要的是，福辛普利能夠調(diào)節(jié)RAS/NO信號對骨質(zhì)疏松癥具有潛在的治療價值。但福辛普利是否直接作用于RAS/NO信號，或還存在其他信號通路需要后續(xù)研究進一步探究。