海帶發酵降解的復合菌種篩選及海藻寡糖產物的檢測

陳 營，孫業梅，楊丹丹，郭 琳

(煙臺大學生命科學學院 山東煙臺 264005)

海帶(Laminariajaponica)又名昆布，是生長于海洋中的大型褐藻，歸屬于光能自養型微生物[1]，是我國歷史最悠久的食用及藥用藻類之一。我國的褐藻資源豐富，海帶在我國北部及東南沿海地區均有大量養殖，是養殖規模最大的重要經濟藻類，具有獨特的工業和食用價值。海帶常年生長在低溫的環境中，生長速度快、適應能力強，藻體中含有大量陸生生物不具有的營養物質和生物活性成分[2]，作為植物生物刺激素在農業中有著廣闊的開發和應用前景[3]。

以海帶為主要原料制備海藻肥料，通常采用化學、物理和生物的方法提取海帶的有效成分，其中的標志性物質是海藻酸。海藻酸是一種酸性大分子的多糖物質，占藻體干質量的22%～44%[4]。當海藻酸以高聚合度的大分子狀態存在時，黏度大、吸收利用差等特性限制了其應用的范圍[5]。同時，海藻酸構成了海帶、馬尾藻、巨藻等褐藻細胞壁的主要成分，也是藻體細胞間骨架的基質[6]。經過提取處理后，海帶藻體結構被破壞，釋放出細胞內的全部營養物質。而海藻酸或其黏度降低，或變成小分子海藻寡糖，水溶性和吸收度增大，呈現更多的生物活性作用，如植物生長的刺激作用和植物抗病力的誘導效應[2]。在海藻的各種提取方法中，生物法因其條件溫和可控、特異性強、綠色無污染，日益受到人們的重視。因此，篩選海帶降解菌或降解酶，最大程度地保證海藻有效成分的完整性，對海藻提取物的應用是至關重要的[3]。目前，大部分的海帶降解菌或降解酶都源于海洋細菌，如弧菌(Vibrio)[5，7-9]、交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)[10-11]、交替單胞菌(Alteromonas)[12]、芽孢桿菌(Bacillus)[13]、Shewanella[14]、Tamlana[15]。生物法的優勢除了反應溫和、無營養損失外，其產物也獨具特殊性。海藻酸經過微生物酶的裂解后，其產物海藻寡糖的非還原端C4與C5間會產生一個雙鍵，在波長235 nm處有最大吸收峰，通過比色法可以測定海藻寡糖的含量[16]。由此制備的非飽和寡糖具有生物學活性，而由其他方法制備的飽和寡糖則不具有[10]。

本文從實驗室保存的海帶降解菌群中分離純化出相關的海帶降解菌，通過分析菌種之間的相互作用，檢測發酵產物中海藻寡糖的組成和含量，篩選并重新組成復合微生物菌種，用于海帶發酵降解制備海藻寡糖的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品，購于煙臺本地市場的干海帶；菌種，本實驗室保存于海帶發酵液中的海帶降解菌群；培養基，富集培養基等參考文獻[17]。

1.2 試驗設備

VD-850型桌上式潔凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；TG16-W型微量高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；LDZX-40BⅠ型立式全自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；隔水式電熱恒溫培養箱，上海市躍進醫療器械一廠；HZQ-F160型振蕩培養箱，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；UV-1900型紫外-可見分光光度計，翔藝儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 海帶降解菌群的活化及分離純化

取保存的海帶發酵液，按5%(體積分數，下同)接種至富集培養基中，在37 ℃、160 r/min下培養至海帶片90%以上分解。繼續傳代培養2次，直至海帶分解效果穩定。取海帶降解液進行適當稀釋后，涂布牛肉膏蛋白胨平板。待平板上有菌落生長后，選取形態不同的菌落反復幾次劃線培養，純化后的菌種留待備用。

1.3.2 微生物菌種之間的相互作用分析

(1)交叉劃線法[18]。 將純化的菌種兩兩之間在牛肉膏蛋白胨平板表面交叉劃線，培養后在兩種菌交叉的地方觀察細菌生長情況。交叉處細菌的生長如果優于單一劃線處的細菌，說明兩種菌之間有相互促進的作用；反之，說明細菌之間沒有相互促進作用。

(2)濾紙片法[19]。先選擇一種菌液涂布于平板表面，然后將滅菌的濾紙片浸入其他的菌懸液中，待濾紙片微干后貼于培養基表面，培養后觀察濾紙片周圍細菌的生長情況。若濾紙片周圍的細菌生長得更好，說明兩細菌之間有相互促進作用；反之，則無作用。

1.3.3 海帶的混合發酵與海藻寡糖含量的測定

取純化的菌種，以等比例混合接種至富集培養基中，在37 ℃、160 r/min下培養4 d。以各自單一菌種接種富集培養基和空白培養基作對照，每組均為兩個平行。發酵結束后，取各自海帶發酵液以4 000 r/min離心10 min，再取上清液稀釋40～50倍，在波長235 nm下測定吸光度，即可比較各發酵液中海藻寡糖含量的差異，從而確定海帶分解的效果。

1.3.4 海帶發酵復合菌種的比例分析

從上述海帶的混合發酵中，選取海帶分解達到90%以上和海藻寡糖含量較高的組合，采用平板培養法對最終發酵液中的菌種計數，確定混合發酵的接種比例。

1.3.5 復合菌種發酵產物的薄層層析

薄層層析所用展開劑為正丁醇∶乙酸乙酯∶異丙醇∶冰乙酸∶水(2∶6∶6∶4∶1)。將點樣的硅膠板放于盛有展開劑的層析缸中，在50 ℃下待樣品擴散至距硅膠板頂端約1 cm處，取出在70 ℃烘烤30 min。 烘干后，均勻噴體積分數為30%的硫酸溶液進行顯色，并在110 ℃烘烤10 min后觀察。以質量分數為1%的葡萄糖、蔗糖溶液作為對照。

1.3.6 混合發酵復合菌種的鑒定

試驗采用煮沸法提取細菌基因組，并進行16S rDNA測序鑒定。PCR擴增引物為細菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。

2 結果與分析

2.1 海帶降解菌的分離和純化

對實驗室保存的海帶發酵液進行連續傳代培養，在37 ℃、160 r/min條件下培養3～4 d，海帶分解達到90%以上。這是一個海帶降解菌群的富集培養液，經過近3年的保存，其混合菌群的種類逐漸變少，但降解海帶的效果仍然很好。經平板涂布分離及劃線純化后，共獲得3種不同菌落形態的菌株，分別命名為Lj1、Lj2和Lj3。

2.2 微生物菌種之間的相互作用

在交叉劃線試驗中，Lj1和Lj2交叉劃線處的細菌生長優于單菌生長，兩菌株之間可能存在相互促進作用；Lj2和Lj3交叉劃線處的細菌生長較差，不如單菌生長，兩菌株之間可能有抑制作用；Lj1和Lj3之間的關系不是很明顯。

在交叉劃線試驗的基礎上進行濾紙片法分析，先將Lj2涂布于平板上，再將浸有Lj1和Lj3 的濾紙片貼在平板表面。結果表明：Lj2的代謝產物促進了Lj1的生長，進一步確定了兩者之間的協同作用；Lj2和Lj3之間作用不明顯或沒有促進作用。

2.3 海帶發酵復合菌種的篩選

經過檢測混合發酵液中海藻寡糖的含量，以Lj1+Lj2組合的含量最高，稀釋50倍后的平均吸光度為0.784，其次為Lj1+Lj3和Lj2+Lj3組合。3種菌株的組合和單一菌株發酵液中，海藻寡糖含量均較低，與空白對照相當，結果見圖1。

圖1 海帶發酵液中海藻寡糖含量測定結果

結合海帶的分解效果，也是Lj1+Lj2組合中的海帶分解最好，在3～4 d可使質量分數30%的濕海帶分解率達90%以上。因此，選用Lj1+Lj2組合作為海帶發酵降解的復合菌種。

2.4 海帶發酵的復合菌種鑒定、菌種比例及產物組成

利用Lj1+Lj2復合菌種發酵海帶，起始接種時兩者是等比例混合。由于兩者之間的偏利共生關系，即Lj2促進Lj1生長的現象，經過3～4 d的混合培養，在發酵結束后經平板計數，最終Lj1和Lj2的活菌數比例變為3∶2。這個比例是兩者在海帶中的最佳比例，也應該是發酵起始接種的合適比例。

復合菌種分別經細菌16S rDNA測序鑒定，Lj1為印度斯塔普氏菌(Stappiaindica)，Lj2為陶氏假單胞菌(Pseudomonastaeanensis)。斯塔普氏菌是一種不常見的細菌，而假單胞菌在自然界中廣泛存在，對各種碳源物質的利用種類最多、能力最強。

通過薄層層析對海帶發酵液中海藻寡糖種類進行分析時發現，海帶發酵液的層析斑點完整、不拖尾，在蔗糖附近略靠下的位置。由此可以推測海帶發酵液中的海藻寡糖大致為單一組分的三糖，見圖2。

圖2 海帶發酵液的薄層層析分析

3 結語

海帶的細胞壁組成十分復雜，含有海藻酸和其他的多糖成分，這些可以成為微生物生長繁殖的營養物質和能源[20]。只有能利用這些物質的微生物才能將其降解成小分子，破壞細胞壁的保護結構，釋放出細胞內的營養物質。因此，利用不同菌種的代謝酶系，可以更好地協同作用，更快、更有效地降解海帶。從實驗室保存的海帶降解菌群中共獲得3株細菌，通過分析兩種不同方法的菌種之間的相互作用，得出Stappiaindica和Pseudomonastaeanensis之間有協同促進作用；對不同菌種組合的海帶發酵產物進行235 nm光吸收檢測，也表明這兩個菌種組合產生的海藻寡糖含量最高，分解海帶的效果最好，而任一單菌種或其他組合效果都不好。所以，后續的研究選用Stappiaindica和Pseudomonastaeanensis作為海帶發酵降解的復合菌種。Sun等[21]在海帶的表面分離到一株細菌Bordetellasp. HZ20，這株菌沒有分解海帶的能力，但可能具有分解幾丁質和聚羥基脂肪酸酯(PHA)酶系的能力，與其他菌共同參與碳、氮、磷、硫的代謝，這或許是該菌在海帶表面生態系統中存在的意義。

試驗分離的假單胞菌是自然界中利用碳源物質能力最強的細菌，如海帶含有的各種多糖。在與斯塔普氏菌混合發酵海帶的過程中，假單胞菌產生的代謝產物促進Stappiaindica的生長，兩者共同作用使海帶降解。Stappiaindica在這個過程中可能具有獨特針對海帶中某種成分的利用和分解能力，有待進一步驗證。此復合菌種在4 d之內可使質量分數30%的濕海帶幾乎全分解，而且產物經薄層層析推測為單一的三糖。柏超[15]從海帶降解菌群中分離到兩株高效降解菌株，其中假單胞菌具有淀粉酶、果膠酶、纖維素酶和海藻酸裂解酶活性，Tamlana具有海藻酸裂解酶活性。利用這兩株菌的重新組合，只需要5 d就可以把培養基中質量分數20%的海帶塊完全降解。姚艷艷等[8]利用弧菌 YY7 菌株發酵液降解海帶粉，酶解6 h的降解率可達 65% 以上。湯海青[10]通過薄層層析推測由海藻酸裂解酶制備的產物為寡糖混合液，各寡糖的聚合度為2～9，其中以聚合度2～6的寡糖為主，酶解的終產物為二糖和三糖。可見，從不同環境分離的菌株，降解海帶的能力不同。菌種的組合不同、反應條件不同，對海帶的降解效率和產物組成是有差異的。為實現海帶發酵降解的工業化生產，后續還將進行菌種的穩定性和發酵工藝優化的研究。同時，亟待建立檢測海藻寡糖的方法并制定相應的標準。