重癥膿毒癥患者病原學診斷中應用高通量測序技術的價值分析

曹燕 劉易林 李莉 李曉勇 孫燁 鐘利民 謝恒 劉科成

【摘要】目的探究高通量測序技術（HTS）對重癥膿毒癥患者的病原學診斷價值。方法選取122例重癥膿毒癥患者，隨機分為研究組（62例）和對照組（60例）。研究組患者采用血培養（BC）聯合HTS檢測，對照組患者采用BC檢測。兩組患者均接受經驗性抗感染治療。統計病原學診斷結果及類型，并比較兩組病原學診斷陽性率、病毒診斷陽性率;比較兩組接受經驗性抗感染治療后診斷陽性率、重癥監護病房（ICU）住院時間、28d生存率、并發癥發生情況。結果研究組62例患者中58例患者病原學診斷結果陽性，對照組60例患者中24例患者病原學診斷結果陽性。研究組患者病原學診斷陽性率93.55%（58/62）高于對照組的40.00%（24/60），病毒診斷陽性率20.97%（13/62）高于對照組的0（0/60），差異均有統計學意義（X2=39.675、14.081，P<0.05）。接受經驗性抗感染治療后，研究組診斷陽性率為32.26%，高于對照組的15.OO%，差異有統計學意義（x2=5.012，P<0.05）;兩組并發癥發生率比較差異無統計學意義（P>0.05）。研究組ICU住院時間（10.04±2.06）d短于對照組的（18.25±2.87）d，28（1生存率85.48%高于對照組的56.67%，差異有統計學意義（P<0.05）。結論HTS檢測范圍廣，能夠提高對重癥膿毒癥患者病原微生物的診斷陽性率，為重癥膿毒癥患者抗感染方案的選擇提供方向，以避免盲目使用抗生素，縮短ICU住院時間，提高生存率。

【關鍵詞】膿毒癥;重癥;高通量測序技術;病原學;診斷價值

DOl： 10.14163/j.cnki.ll-5547/r.2020.19.002

Value analysis of high-throughput sequencing technology in pathogenic diagnosis of patients withsevere sepsis CAO Yan.LLU Yi-Lin，et at Department of Critical Care Medicine，Yuebei Peoples Ho.spital，Shaoguan 512026，China

【Abstract】Objective To investigate the value of high-throughput sequencing （HTS）technology inpathogenic diagnosis of patients with severe sepsis. Methods A total of 122 patients with severe sepsis wererandomlv divided into research group 62 （cases） and control group （60 cases）. Patients in the research groupreceived blood culture （BC） combined HTS test， and patients in the control group received BC test. Both groupsof patients received empirical anti-infective treatment. The results and types of pathogen diagnosis was collectedand the positive rate of pathogen diagnosis and virus diagnosis were compared between the two groups. Thediagnostic positive rate after empirical anti-infective treatment， hospitalization time in intensive care unit （ICU）.28 d survival rate and occurrence of complications were compared between the two groups. Results There were58 patients with positive pathogen diagnosis in 62 patients of the research group， and 24 patients with positivepathogen diagnosis in 60 patients of the control group. The positive rate of pathogen diagnosis 93.55%（58/62） ofthe research group was higher than than of the control group 40.OO%（24/60）， and positive rate of virus diagnosis20.97%（13/62） was higher than that of the control group 0（0/60）， and the difference was statistically significant（X2=39.675， 14.081. P<0.05）. After empirical anti-infective treatment， the diagnosis-positive rate of the researchgroup was 32.26%. which was higher than that of the control group 15.00%. and the difference was statisticallysignificant （X2=5.012， P<0.05）. There was no statistically significant difference in incidence of complicationsbetween the two groups （P>0.05）. The hospitalization time in ICU （10.04 ± 2.06） d of the research group wasshorter than that of the control group （18.25 ± 2.87） d. and 28 d survival rate 85.48% was higher than that of thecontrol group 56.67%， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion HTS has a widerange of detection. and can improve the diagnosis-positive rate of pathogenic micrrganisms in patients withsevere sepsis， and provide direction for the selection of anti-infective programs for severe sepsis to avoid blind useof antibiotics. shorten the hospitalization time in ICU， and improve survival rate.

【Key words】 Sepsis; Severe; High-throughput sequencing technology; Pathogenic; Diagnlstic value

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，可導致嚴重膿毒癥和膿毒性休克，是ICU患者死亡的主要原因。據文獻報道，全球膿毒癥發病率約0.3%，病死率可達25%，并發膿毒性休克患者病死率高達80%[1]。高通量測序技術（high-throughput sequencing，HTS），即二代測序技術，近年來應用廣泛，被證實可用于腫瘤的診治、感染性疾病診斷、遺傳疾病篩查[2]。國外研究顯示，HTS常用于病毒感染診斷，相比血培養（bacterialculture，BC）具有明顯優勢[3]。但目前國內外HTS應用于膿毒癥病原學診斷的前瞻性研究報道罕見。鑒于本院重癥膿毒癥約占膿毒癥患者的2/3，本研究探析HTS對重癥膿毒癥患者病原學的診斷價值，以期為臨床應用提供新的方向和依據。現報告如下。

1資料與方法

1.1 一般資料選取2016年7月-2019年10月本院收治的122例重癥膿毒癥患者為研究對象，隨機分為研究組（62例）和對照組（60例）。研究組：男37例，女25例;年齡22-79歲，平均年齡（59.86±9.27）歲;急性生理學及慢性健康狀況評分系統Ⅱ（acute physiologyand chronic health evaluationⅡ.APACHEⅡ）評分[4]11-17分，平均APACHEⅡ評分（14.26±3.24）分;序貫器官衰竭評估（sequential organ failure assessment. SOFA）[5]4-7分，平均SOFA評分（5.78±1.41）分。對照組：男35例，女25例;年齡24-77歲，平均年齡（59.29±9.18）歲;APACHEⅡ評分10-17分，平均APACHEⅡ評分（14.15±3.19）分;SOFA評分3-7分，平均SOFA評分（5.59±1.37）分。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。納入標準：①重癥膿毒癥符合《中國嚴重膿毒癥/膿毒性休克治療指南》[6]中診斷標準;②年齡>18歲;③患者家屬知情同意。排除標準：①血液系統、自身免疫性疾病;②合并惡性腫瘤;③器官功能不全終末期;④入院24h內死亡;⑤妊娠、哺乳期婦女;⑥長期服用抗生素或其他影響本研究結果的藥物;⑦嚴重創傷、甲狀旁腺功能異常。所有患者及其家屬知情同意本研究并簽署知情同意書。本研究所涉及的研究方法均遵循《赫爾辛基宣言》，符合醫學倫理學原則，并獲得粵北人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2方法研究組患者采用BC聯合HTS檢測，對照組患者采用BC檢測。具體如下。

1.2.1 BC檢測采用Bact/ALERT 3D血培養儀及配套血培養瓶進行BC;通過VITEK 2 Compact全白動微生物分析系統（法國生物梅里埃公司）進行病原微生物鑒定。

1.2.2 HTS檢測 ①構建DNA文庫：對血樣離心

10 min/1600g，分離血漿，轉移血漿至無菌試管;通過微量樣本基因組DNA提取試劑盒（DP316，天根生化科技北京有限公司）提取血漿中DNA，用于DNA文庫構建。②測序：先行PCR擴增f美國ABI公司，7500FAST型實時熒光定量PCR儀），并使用IonTorrent基因組測序儀（Life TeChnologies公司）分析，結合Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies公司）分析，評定DNA文庫質量，而后進行測序。采用IonTorrent Proton測序儀（Life TeChnologies公司）對合格DNA文庫展開測序，分析得出報告。③預處理及參考數據庫：去除低質量序列、短序列（長度<35 hp），完成預處理;采用Burrows-Wheeler比對工具將測序數據與人類參考基因組（GRCh37）進行比對，并將數據與細菌、真菌、病毒數據庫進行比對，讀取計數及每種物種的基因組覆蓋率。所有病原體序列參考數據庫均來白NCBI。④測定病原體：根據以往對正常者血漿樣品的測序計算細菌、真菌、病毒的參考范圍，確定通過干凈序列讀數標準化的每種生物的檢測值，采用箱線圖計算正常樣本范圍，以Q3+3IQR最大、Q1-3IQR為最小（Q1、Q3分別為較低四分位數和較高四分位數，IQR為四分位數間距），獲取細菌、真菌、病毒的讀碼數。根據以下確定患者是否存在病原生物：一是必須根據每種生物的覆蓋率對一個樣品中鑒定出的所有生物進行分類，獲得了前十個清單則進一步分析;二是在前十個生物中，嚴格映射的讀數必須為03，并且超過參考范圍的上限，覆蓋率也必須超過參考范圍的上限。⑤Sanger測序驗證：對于HTS和BC陽性結果，采用特異性PCR驗證。將提取的DNA作為PCR反應模板，反應條件為：94。C5 min（94。C 30s;55℃50s;72℃30s），40循環，72℃5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并純化;以ABI 3730基因分析儀進行Sanger測序，驗證測序結果。

兩組患者均接受經驗性抗感染治療。

1.3觀察指標統計病原學診斷結果及類型，并比較兩組病原學診斷陽性率、病毒診斷陽性率;比較兩組接受經驗性抗感染治療后診斷陽性率、ICU住院時間、28d生存率、并發癥發生情況。

1.4統計學方法采用SPSS22.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用i檢驗;計數資料以率（%）表示，采用X2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1病原學診斷結果及類型研究組62例患者中58例患者病原學診斷結果陽性，對照組60例患者中24例患者病原學診斷結果陽性。研究組患者病原學診斷陽性率93.55%（58/62）高于對照組的40.OO%（24/60），病毒診斷陽性率20.97%（13/62）高于對照組的0（0/60），差異均有統計學意義（X2=39.675、14.081，P<0.05）。見表1。

2.2兩組接受經驗性抗感染治療后的診斷陽性率及并發癥發生率比較接受經驗性抗感染治療后，研究組診斷陽性率為32.26%，高于對照組的15.OOo%，差異有統計學意義（X2=5.012， P<0.05）;兩組并發癥發生率比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3兩組ICU住院時間、28 d生存率比較研究組ICU住院時間短于對照組，28 d生存率高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3討論

目前ICU感染的病原學診斷仍然依賴于BC和分子技術，而BC被認為是診斷血流感染的金標準，但它陽性率較低，一般只能進行細菌/真菌培養，且并非所有的病原體都能被培養出，同時培養周期較長（3-7d），雖然反復培養可增加陽性概率，但同時將增加患者經濟負擔，且可能延誤最佳治療時機，因此它具有一定局限性[7，8]。國外研究報道，延遲th的有效抗菌及支持治療可導致患者死亡率增加5%-10%[9]。而由于臨床診斷技術層面的局限性，30%-50%膿毒癥患者難以明確病原微生物，造成初治延遲或失敗，增加病死率[10]。因此，探尋準確、快速的病原學診斷方法，以促進臨床實施早期精準的抗感染治療方案，提高重癥膿毒癥患者生存率，成為研究的重點。

自2016年7月開始，本研究對傳統的膿毒癥病原學診斷方法進行了改良，在常規BC的基礎上聯合應用HTS對重癥膿毒癥患者進行病原體檢測，取得了良好效果。研究組病原體診斷陽性率為93.55%，明顯高于對照組（40.OO%），同時對于已經接受了經驗性抗感染治療的患者，研究組診斷陽性率（32.260%）明顯高于對照組（15.OO%）。本研究進一步發現，研究組ICU住院時間明顯短于對照組，28d生存率明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。另近年Gumaz等[11]研究發現，與BC相比，HTS檢測膿毒癥的病原菌有較高的敏感性和特異性。HTS應用于ICU重癥膿毒癥患者病原微生物檢測可提高診斷價值，這可能與HTS可篩選出標本中核酸所含種類，可全面分析物種轉錄組及基因組，還能夠對宿主miRNAs進行檢測，也可獲得含量低的病原序列，并通過未知序列鑒定新物種，若預先定義每種病原微生物的特征序列譜，在測序結果中逐一比對，可以迅速識別各類病原微生物，使診斷時間縮短，診斷結果更加精確[12-14]。目前HTS能檢測出約2700余種病原體，種類包括細菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體、衣原體、立克次氏體，48-96h得出報告，具有檢測速度快、準確率高、成本低、覆蓋度廣及產出巨大等特點[15-16]，特別是病毒、支原體、衣原體等少見病原體類型的病原學診斷，HTS較BC具有更加獨特和明顯的優勢[ 17，18]。在重癥膿毒癥患者的治療中，BC聯合HTS可明顯縮短ICU住院時間，同時可明顯提高28d生存率，這可能與HTS能更快速和精準地檢測出病原菌，促進臨床早期選擇合理的治療方案，避免或減少抗生素的不合理應用，從而提高重癥膿毒癥患者的存活率，改善患者的治療預后，同時也降低了患者的治療費用。

綜上所述，HTS檢測范圍廣且時間短，能夠提高對重癥膿毒癥患者病原微生物的診斷陽性率，可為重癥膿毒癥患者抗感染方案的選擇提供方向，以避免盲目使用抗生素，縮短ICU住院時間，提高生存率，具有重要應用價值。但本研究樣本量較少，且全為本院患者，可能影響其可靠性，今后還有待進行大樣本、多中心研究檢驗。

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[收稿日期 ： 2020-04-16]

基金項目：韶關市科技汁劃項目（項目編號：2018sn109）;韶關市衛生計生科研項目（項目編號：Y18064）作者單位：512026粵北人民醫院重癥醫學科