二苯乙烯苷對(duì)AD模型小鼠Tau蛋白Thr205和Ser404位點(diǎn)磷酸化的影響

吳文雪 蘇彥兆 劉超宇 蒙婉瑩 李振中 黃健 朱曉瑩 廖艷花 黃忠仕

摘 要 目的：研究二苯乙烯苷（TSG）對(duì)阿爾茨海默病（AD）模型小鼠Tau蛋白Thr205、Ser404位點(diǎn)磷酸化的影響，探索TSG抗AD的可能機(jī)制。方法：將APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因癡呆（3×Tg-AD）小鼠隨機(jī)分成模型組、陽性對(duì)照組（石杉?jí)A甲，0.15 mg/kg）和TSG 低、中、高劑量組（0.033、0.1、0.3 g/kg），每組6只;另取6只C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，模型組和正常對(duì)照組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥60 d。末次給藥結(jié)束后，采用免疫熒光染色法檢測(cè)各組小鼠腦組織中Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的分布和表達(dá);采用Western blotting法檢測(cè)各組小鼠腦組織中磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）表達(dá)增多、容易聚集成團(tuán)、分布更為廣泛，相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.01），且Western blotting結(jié)果顯示磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，陽性對(duì)照組和TSG各劑量給藥組小鼠腦組織中Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）表達(dá)和聚集減少、分布范圍變窄，相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.01），且Western blotting結(jié)果顯示磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的表達(dá)水平也顯著降低（P<0.01）;與陽性對(duì)照組比較，TSG各劑量給藥組小鼠腦組織中Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的分布情況差別不大，相對(duì)表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但Western blotting結(jié)果顯示TSG中、高劑量組小鼠腦組織中磷酸化Tau蛋白（Thr205位點(diǎn)）的表達(dá)水平和TSG各劑量組小鼠腦組織中磷酸化Tau蛋白（Ser404位點(diǎn)）的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：TSG可能通過下調(diào)腦組織中磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的表達(dá)，從而發(fā)揮其對(duì)AD模型小鼠的抗癡呆作用。

關(guān)鍵詞 阿爾茨海默病;二苯乙烯苷;3×Tg-AD小鼠;Tau蛋白;磷酸化;Thr205位點(diǎn);Ser404位點(diǎn)

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of stilbene glycosidec （TSG） on phosphorylation of Thr205，Ser404 sites of Tau protein in Aizheimers disease （AD） model mice， and to investigate the potential anti-AD mechanism of TSG. METHODS： APP/PS1/Tau three transgenes （3×Tg-AD） mice were randomly divided into model group， positive control group（huperzine， 0.15 ? ? ?mg/kg）， TSG low-dose， medium-dose and high-dose groups（0.033， 0.1， 0.3 g/kg）， with 6 mice in each group. In addition， 6 C57BL/6J mice were chosen as normal control group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically. Model group and normal control group were given equal volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 60 days. After last medication， immunofluorescence staining was used to detect Tau protein and phosphorylated Tau protein （Thr205， Ser404 sites） distribution and expression in brain tissue of mice in each group. Western blotting assay was used to detect phosphorylated Tau protein （Thr205， Ser404 sites） expression level in brain tissue of mice in each group. RESULTS： Compared with normal control group， the expression of Tau protein， phosphorylated Tau protein （Thr205， Ser404 sites） in the brain tissue of mice were increased in model group， which were easy to aggregate and distributed more widely; their relative expression were increased significantly （P<0.01）. Results of Western blotting assay showed that the expression levels of phosphorylated Tau protein （Thr205， Ser404 sites） were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the expression of Tau protein， phosphorylated Tau protein （Thr205， Ser404 sites） in the brain tissue of mice were decreased in positive control group and TSG groups; aggregation decreased， distribution narrowed and their relative expression were decreased significantly （P<0.01）. Results of Western blotting assay showed that the expression levels of phosphorylated Tau protein （Thr205， Ser404 sites） were decreased significantly （P<0.01）. Compared with positive control group， There was no significant difference in the distribution of Tau protein， phosphorylated Tau protein （Thr205， Ser404 sites） in the brain tissue of mice in TSG groups; the relative expression were not statistically significant （P>0.05）; but Western blotting assay showed the expression levels of phosphorylated Tau protein （Thr205 site） in TSG medium-dose and high-dose groups as well as the expression levels of phosphorylated Tau protein （Ser404 site） in TSG groups were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS：TSG can play an anti-AD effect on AD model mice by down-regulating the expression of phosphorylated Tau protein （Thr205， Ser404 sites） in brain tissue.

KEYWORDS ? Alzheimers disease; Stilbene glycoside; 3×Tg-AD mice; Tau protein; Phosphorylation; Thr205 site; Ser404 site

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）也稱老年癡呆，是一種常見的不可逆轉(zhuǎn)的中樞神經(jīng)退行性疾病[1]。《2018年世界阿爾茨海默病報(bào)告》指出：AD在全球的患病人數(shù)已達(dá)5 000萬，而且還在全球以每3秒就產(chǎn)生1名患者的速度不斷增加;預(yù)計(jì)到2030年，僅用于治療AD的總花費(fèi)就將高達(dá)2萬億美元。然而，AD作為全球衛(wèi)生醫(yī)療亟待攻克的一個(gè)重大疾病，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡釋清楚，目前暫無藥物可以有效預(yù)防或根治該病[2-3]。Tau蛋白是一種重要的微管相關(guān)蛋白，其主要生理功能是促進(jìn)微管的組裝與結(jié)合，以及參與神經(jīng)元極性的建立和維持[4]。越來越多的研究指出，Tau蛋白多個(gè)位點(diǎn)的異常磷酸化是介導(dǎo)AD患者認(rèn)知障礙的關(guān)鍵原因，其中主要的位點(diǎn)包括Thr205、Ser404等[5-7]。

二苯乙烯苷（TSG）是從何首烏中提取的一種重要化合物，具有抗衰老、神經(jīng)保護(hù)等藥理功效[8]。多項(xiàng)研究指出，TSG能一定程度減少AD模型小鼠β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生和神經(jīng)元凋亡，增加其突觸可塑性，從而改善AD模型小鼠的認(rèn)知與記憶能力，起到神經(jīng)保護(hù)的作用[9-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TSG能夠通過抑制AD發(fā)病關(guān)鍵蛋白——Tau蛋白相關(guān)位點(diǎn)的磷酸化水平，從而達(dá)到保護(hù)AD模型細(xì)胞的作用[11]。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇高表達(dá)Tau基因P301L位點(diǎn)突變的APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因癡呆（3×Tg-AD）小鼠作為研究對(duì)象，開展TSG對(duì)3×Tg-AD小鼠腦組織中Tau蛋白磷酸化（Thr205、Ser404位點(diǎn)）影響的體內(nèi)研究，進(jìn)一步探索該藥物抗AD的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

CM1650型冷凍切片機(jī)（德國Leica公司）;D1MI- 3000B型熒光倒置顯微鏡[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司];Neofuge15R型高速冷凍離心機(jī)（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）;ME204E型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];SpactraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）;Tanon-5200 multi型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

TSG（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)：CHB180810，含量：≥70%）;石杉?jí)A甲片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：191211202，規(guī)格：50 μg/片）;高效RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液（美國MedChemExpress公司，批號(hào)：20190622）;磷酸蛋白酶抑制劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：01385/30429）;苯甲基磺酰氟（PMSF，批號(hào)：20190926）、牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)：20200605）均購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗小鼠Tau蛋白多克隆抗體（批號(hào)：0083660）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)：20000174）均購自美國Proteinech Group公司;兔抗小鼠磷酸化Tau蛋白（Thr205位點(diǎn)）多克隆抗體（批號(hào)：2001242）、兔抗小鼠磷酸化Tau蛋白（Ser404位點(diǎn)）多克隆抗體（批號(hào)：SG255476）均購自美國Invitrogen公司;10%PAGE凝膠快速制備試劑盒（批號(hào)：02431400）、Omini-ECLTM超靈敏感化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：02391063）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號(hào)：013B1050）、5×蛋白快速封閉液（批號(hào)：0141189）均購自上海雅酶生物科技有限公司;Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG （H+L）高交叉吸附二抗（批號(hào)：S0006）、DAPI染料（批號(hào)：1387190）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

本研究使用的動(dòng)物包括高表達(dá)Tau基因P301L位點(diǎn)突變的APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因癡呆（3×Tg-AD）小鼠和遺傳背景相近的C57BL/6J小鼠兩種品系，均為雄性、SPF級(jí)。3×Tg-AD小鼠購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室（健康證書編號(hào)：1611A18008），6周齡，體質(zhì)量為（25.02±0.20） g，共36只;C57BL/6J小鼠購自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（湘）2016-0011]，6周齡，體質(zhì)量為（25.20±0.16） g，共6只。所有小鼠購回后均飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（環(huán)境為相對(duì)濕度55%～75%，溫度20～25 ℃），飼養(yǎng)至8月齡時(shí)開始用于實(shí)驗(yàn)。本研究已通過右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的審批，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置均滿足科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

2 方法

2.1 分組與給藥

將36只3×Tg-AD小鼠采用隨機(jī)數(shù)字生成法分為模型組、陽性對(duì)照組（石杉?jí)A甲，0.15 mg/kg）和TSG低、中、高劑量組（0.033、0.1、0.3 g/kg），每組6只;再另取C57BL/6J小鼠6 只作為正常對(duì)照組。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物（以水為溶劑對(duì)TSG和石杉?jí)A甲進(jìn)行溶解），模型組、正常對(duì)照組小鼠灌胃等體積生理鹽水，灌胃體積均為10 mL/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥60 d。TSG及石杉?jí)A甲的給藥劑量和給藥方式均參考本課題組前期已發(fā)表文獻(xiàn)[9]設(shè)置。

2.2 小鼠腦組織中Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的分布與表達(dá)情況檢測(cè)

Tau蛋白由位于人類17號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶3亞帶1次亞帶（17q21.31）上的微管相關(guān)Tau蛋白（Microtubule Associated Protein Tau，MAPT）基因編碼，是一種重要的微管相關(guān)蛋白，主要表達(dá)于機(jī)體大腦組織[4]。Tau蛋白的主要生理功能是促進(jìn)微管的組裝與結(jié)合，以及參與神經(jīng)元極性的建立和維持[4]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)病態(tài)，如MAPT基因水平發(fā)生突變，翻譯得到功能異常的Tau蛋白可參與AD、額顳癡呆、質(zhì)基底變性和進(jìn)行性核上性麻痹等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、進(jìn)展;如Tau蛋白的翻譯后修飾出現(xiàn)磷酸化、糖基化和截?cái)嗟犬惓Ｋ絾栴}，同樣可參與到AD、額顳癡呆等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、進(jìn)展中[17-18]。作為AD的一個(gè)主要病理特征變化，Tau蛋白過度磷酸化不僅影響軸突的運(yùn)輸功能，而且會(huì)破壞神經(jīng)元骨架系統(tǒng)，引起神經(jīng)元毒性及死亡，導(dǎo)致嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙[19]。Tau蛋白包括N端區(qū)域、富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)區(qū)域、微管結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域和C末端區(qū)域4個(gè)主體結(jié)構(gòu)，每個(gè)結(jié)構(gòu)都賦予了Tau蛋白不同的功能[20]。C末端結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域是Tau蛋白的兩個(gè)離散結(jié)構(gòu)域，其主要通過逐步調(diào)控結(jié)構(gòu)域相關(guān)位點(diǎn)的磷酸化水平參與突觸的認(rèn)知障礙：首先，C末端結(jié)構(gòu)域中Ser404位點(diǎn)的磷酸化介導(dǎo)Tau蛋白錯(cuò)誤定位到樹突棘，隨后介導(dǎo)富含脯氨酸的區(qū)域中Thr205位點(diǎn)的磷酸化，共同導(dǎo)致AMPA（α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸）受體數(shù)量減少，引起突觸后功能缺陷[5]。Chukwu JE等[7]的研究指出，與Tau蛋白其他位點(diǎn)磷酸化改變水平相比，磷酸化Tau蛋白（Ser404位點(diǎn)）在AD病變組織中的水平改變是非常明顯的（即具有突出性），故該位點(diǎn)作為理想的治療靶點(diǎn)而備受關(guān)注;而磷酸化Tau蛋白（Thr205位點(diǎn)）在指導(dǎo)AD的Braak分級(jí)系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用，研究表明磷酸化Tau蛋白（Thr205位點(diǎn)）在中晚期Braak分級(jí)系統(tǒng)顯著升高與AD機(jī)體的顳葉、額葉、扣帶和枕葉皮層等之間均具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)[21]。

Thr205、Ser404作為Tau蛋白過度磷酸化的兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，在動(dòng)物水平上研究TSG對(duì)二者的影響具有重要意義。相關(guān)文獻(xiàn)表明，植物來源的乙酰膽堿酯酶抑制劑石杉?jí)A甲已成為我國當(dāng)前臨床治療AD的主流藥物之一[22]，因此本研究選擇同是提取于傳統(tǒng)中藥材的石杉?jí)A甲作為本研究的陽性對(duì)照藥物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腦組織中Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）容易聚集成團(tuán)、分布較廣泛，磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的表達(dá)水平也顯著升高;而給予不同劑量TSG處理后，小鼠腦組織中Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的表達(dá)和聚集均減少、分布范圍均變窄，磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的表達(dá)水平也均顯著降低。該結(jié)果與Yan D等[23]的研究結(jié)果一致，這也進(jìn)一步提示降低小鼠腦組織中Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）磷酸化水平可能是TSG發(fā)揮抗癡呆作用的機(jī)制之一。

綜上所述，TSG可能通過下調(diào)腦組織中磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位點(diǎn)）的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)3×Tg-AD小鼠的抗癡呆作用。然而，本研究還有一定的不足之處，如未能將小鼠按性別、年齡等不同分層次給藥等，在未來的研究中筆者將進(jìn)一步考慮這些因素的影響。

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（收稿日期：2020-09-08 修回日期：2020-10-27）

（編輯：林 靜）