外泌體：蘊(yùn)含“大寶藏”的小囊泡

顏珊珊　張鋒　黃浩

摘要 對(duì)外泌體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。外泌體是多種細(xì)胞均可分泌的一種納米級(jí)胞外囊泡，能攜帶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和復(fù)雜RNA等生物活性物質(zhì)，通過(guò)與細(xì)胞膜融合釋放囊泡內(nèi)容物進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境，影響鄰近或遠(yuǎn)處細(xì)胞。外泌體可參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，尤其在腫瘤微環(huán)境中通過(guò)傳遞癌或抑癌信息，影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。

關(guān)鍵詞 外泌體 生物標(biāo)志物 藥物運(yùn)輸 載體

中圖分類號(hào) Q-49 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 E

細(xì)胞是生命系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，每時(shí)每刻都在進(jìn)行著新陳代謝，產(chǎn)生各種各樣的物質(zhì)，其中既有細(xì)胞代謝產(chǎn)生的“壞東西”，也有一些可被其他細(xì)胞利用的“好東西”。曾經(jīng)人們一直認(rèn)為這些細(xì)胞代謝排出的“垃圾”都被一種稱之為“外泌體”的囊泡狀結(jié)構(gòu)所收集并運(yùn)輸，因此把“外泌體”稱為細(xì)胞的“垃圾袋”。然而，隨著生命科學(xué)的研究，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)外泌體是細(xì)胞之間交流的一個(gè)重要分子，其中豐富的內(nèi)容物具有重要的生物學(xué)意義。研究還發(fā)現(xiàn)，外泌體可作為臨床疾病診斷的生物標(biāo)志物和藥物運(yùn)輸?shù)妮d體。可以說(shuō)，外泌體己經(jīng)不再是以前的“垃圾袋”了，而是蘊(yùn)含著“大寶藏”的小囊泡。下面將對(duì)外泌體及其在疾病診療中的應(yīng)用進(jìn)行概述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的發(fā)現(xiàn)

早在1983年，科學(xué)家分別在大鼠和綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中觀察到一種由細(xì)胞產(chǎn)生、通過(guò)與質(zhì)膜融合而釋放的胞外囊泡，隨后Johnstone將其命名為“Exosome”——外泌體。起初外泌體被認(rèn)為是容納細(xì)胞碎片和代謝廢物的“袋子”，但后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)外泌體的“本領(lǐng)”不小，它不僅參與細(xì)胞免疫，而且可攜帶mRNA、微小RNA （miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA （lncRNA）和線粒體RNA等核酸內(nèi)容物，完成細(xì)胞間相互的信息傳遞。外泌體還具有生物學(xué)活性，是細(xì)胞間通信的重要信號(hào)載體，由此引發(fā)了針對(duì)外泌體的研究熱潮。

1.2 外泌體的形成

外泌體是一種直徑約30-150 nm、具有脂質(zhì)雙分子層的囊泡。機(jī)體中眾多類型細(xì)胞如肥大細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、表皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等均可釋放外泌體。外泌體廣泛存在于各種體液中，如血液、尿液、唾液、母乳、腦脊液和胸腔積液等。

外泌體的形成方式不同于普通微囊泡的出芽，它起源于早期胞內(nèi)體，隨著胞質(zhì)內(nèi)miRNA、酶分子和熱休克蛋白等一些“寶貝”的包裹進(jìn)入，逐漸形成晚期胞內(nèi)體即多囊泡小體（multivesicular bodies，MVBs），MVBs與細(xì)胞膜融合，以胞吐方式向細(xì)胞外釋放小囊泡，即外泌體。

2 外泌體的結(jié)構(gòu)與組成

體液中的外泌體主要呈球形，而在電鏡下主要為杯形。外泌體由脂質(zhì)雙分子層的外膜和內(nèi)容物構(gòu)成，其中蘊(yùn)含的“大寶藏”主要包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA等生物活性物質(zhì)，但是缺乏高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等普通細(xì)胞中常見(jiàn)的細(xì)胞器。

2.1 外泌體中的脂質(zhì)

外泌體富含脂質(zhì)，脂質(zhì)成分與細(xì)胞膜接近，包括鞘磷脂、膽固醇、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和神經(jīng)酰胺等。這些脂質(zhì)既能維持外泌體的結(jié)構(gòu)，也能保護(hù)內(nèi)容物的成分完整。此外，一些特定脂質(zhì)還能承擔(dān)細(xì)胞間通訊介導(dǎo)因子的角色。

2.2 外泌體中的蛋白質(zhì)

外泌體所含蛋白質(zhì)種類繁多，一般由其母代細(xì)胞決定，大致可分為非特異性蛋白質(zhì)和特異性蛋白質(zhì)。非特異性蛋白質(zhì)是指幾乎所有外泌體均含有的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞骨架蛋白、跨膜蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白、核糖體蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子以及黏附因子等。其中四跨膜蛋白（例如CD9、CD37和CD63等）在外泌體表面高度富集，能夠促進(jìn)其他膜蛋白的運(yùn)輸、穩(wěn)定性和低聚。因此可借助蛋白免疫印跡法，通過(guò)檢定CD63或CD9的條帶及鈣聯(lián)蛋白含量來(lái)證實(shí)外泌體提取的純度。外泌體還含有由特定細(xì)胞分泌的特異性蛋白質(zhì)，如腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體上攜帶的大量腫瘤抗原;抗原呈遞細(xì)胞分泌的外泌體含有的高水平的Ⅱ類組織相容性復(fù)合物（maj or histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ）;急性腎損傷患者的尿外泌體中表達(dá)顯著增高的胎球蛋白A等，這些特異性蛋白質(zhì)可能與介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，在免疫和腫瘤等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，也使得外泌體可以作為疾病或腫瘤的標(biāo)志物。

2.3 外泌體中的核酸

外泌體含有豐富的核酸，包括基因組DNA和多種RNA。外泌體RNA包括少量mRNA以及非編碼RNA。這些非編碼RNA包括miRNA、IncRNA、小核RNA（small nuclearRNA， snRNA）和轉(zhuǎn)移RNA（ transfer-RNA，tRNA）等。Valadi等首次證明了在外泌體中有miRNA的存在以及通過(guò)外泌體在細(xì)胞間進(jìn)行運(yùn)輸，親本細(xì)胞釋放的miRNA通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。

3 外泌體的生理病理功能

越來(lái)越多的研究表明外泌體不是細(xì)胞的“垃圾袋”，而是具有重要生物學(xué)功能的“寶箱”。在正常細(xì)胞中，外泌體參與許多生理過(guò)程，如凝血、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞分化、組織再生和自噬等。還有研究顯示，外泌體通過(guò)參與神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互信息傳遞，從而調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng)和突觸形成。在腫瘤細(xì)胞中，外泌體可以與附近甚至遠(yuǎn)處的細(xì)胞傳遞信息，能在一定程度上改變局部基質(zhì)細(xì)胞行為，產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤血管生成、免疫抑制等有利于腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的促腫瘤微環(huán)境。因此，外泌體無(wú)論在正常細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞中都具有重要的生物學(xué)功能。

4 外泌體在疾病診療中的應(yīng)用

4.1 生物標(biāo)志物

隨著腫瘤研究的不斷深入，腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)志物己逐漸成為腫瘤診斷中必不可少的檢測(cè)項(xiàng)目。外泌體中含有大量與來(lái)源細(xì)胞相關(guān)的核酸和蛋白質(zhì)，磷脂雙分子層可以保護(hù)其免被降解，又因?yàn)槠鋸V泛存在于體液中，容易獲得且檢測(cè)更加靈敏，因此可作為液體活檢的檢測(cè)靶點(diǎn)。外泌體具有一定的細(xì)胞特異性，攜帶大量與來(lái)源細(xì)胞相關(guān)的生物活性分子，這些特征性物質(zhì)在正常和病理?xiàng)l件下含量的差異具有衡量細(xì)胞生理狀態(tài)的潛力，因此外泌體在疾病的早期診斷中具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。目前常見(jiàn)的外泌體中分子檢測(cè)物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)。Melo等人通過(guò)對(duì)大量胰腺癌患者的血清樣本分析發(fā)現(xiàn)，患者血清中富含多糖磷脂酰肌醇聚糖-1（GPC-1），這是一種胰腺癌病人中癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體所特有的蛋白多糖，其能夠以百分百的敏感性和準(zhǔn)確性診斷出早期和晚期胰腺癌。Zhao等人將直接定量的方法應(yīng)用于臨床樣品并結(jié)合基于RNA的miRNA篩選分析，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中證實(shí)了血液中miR-106a的上調(diào)，表明miR- 106a是轉(zhuǎn)移性乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物。Skotland等人通過(guò)比較前列腺癌患者和健康對(duì)照組志愿者中尿液外泌體脂質(zhì)成分的差異，首次發(fā)現(xiàn)外泌體脂質(zhì)在尿液中作為前列腺癌生物標(biāo)志物的潛在用途。

4.2藥物載體

由于人體存在保護(hù)機(jī)制，很多治療藥物不能穿過(guò)人體的血腦屏障，阻礙藥物輸送，并且有可能導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。而外泌體作為新型藥物載體具有諸多優(yōu)勢(shì)：①外泌體是天然的，僅有納米級(jí)大小，與質(zhì)膜構(gòu)造非常相似，能夠跨越血腦屏障，避免被吞噬以及降低自身免疫反應(yīng);②外泌體能夠在生理和病理?xiàng)l件下實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，穩(wěn)定性好，因此可以將藥物運(yùn)送到特定細(xì)胞;③外泌體具有親水性，可以運(yùn)送水溶性藥物，也可以通過(guò)與脂質(zhì)融合運(yùn)送外源性疏水物質(zhì)。研究表明外泌體經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)牡鞍仔揎椏梢匝娱L(zhǎng)在血液中的循環(huán)時(shí)間，并靶向遞送藥物至肺癌細(xì)胞，提高肺癌患者的生存率。O' BRIEN研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)工程化改造間充質(zhì)干細(xì)胞以分泌富含miR-379的外泌體用于乳腺癌的體內(nèi)治療，取得了很好的療效。此外，研究者在試圖解決神經(jīng)退行性疾病病理過(guò)程中發(fā)現(xiàn)外泌體可以作為治療的天然遞送載體，HaKatsu-da等人在研究中發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體含有腦啡肽酶，能夠減少3-淀粉樣蛋白肽（ am-yloid3-protein，A[3）的聚集，從而減輕阿爾茨海默氏癥（ Alzheimer's disease，AD）的癥狀。

5 挑戰(zhàn)與展望

外泌體在生物細(xì)胞體系中廣泛存在，其生物學(xué)功能也漸漸被人們所發(fā)現(xiàn)，小小的外泌體竟然蘊(yùn)含著“大寶藏”！外泌體在疾病診斷和藥物送遞方面有著令人興奮的應(yīng)用前景，但是在研究的道路上還是存在著不少挑戰(zhàn)。首先，外泌體在研究過(guò)程中存在分離純化成本較高、操作復(fù)雜等問(wèn)題;其次，檢測(cè)樣本中包含有許多與外泌體相似的組成，如細(xì)胞碎片和其他細(xì)胞外囊泡或微泡，會(huì)干擾鑒定的準(zhǔn)確性;最后，由于外泌體裝載藥物容量有限，使得靶細(xì)胞或靶器官的藥物濃度可能無(wú)法滿足治療需要。因此，研究更加高效的分離純化技術(shù)，提升檢測(cè)的靈敏度和特異性，是外泌體真正成為臨床生物標(biāo)志物必須跨越的障礙;優(yōu)化藥物的加載方式，研發(fā)精確、無(wú)副作用的靶向系統(tǒng)，是外泌體真正承擔(dān)臨床藥物運(yùn)輸載體必須面對(duì)的困難。相信隨著研究的深入和技術(shù)創(chuàng)新，外泌體將會(huì)為臨床疾病特別是腫瘤的診斷和治療提供新的思路和方案。

參考文獻(xiàn)：

[1] OHNSTONE R M，ADAM M，HAMMOND J R，et al.Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association ofplasma membrane activities with released vesicles （exosomes）[J]. Journal of Biological Chemistry， 1987， 262 （19）： 9412-9420.

[2] AILAWADI S，WANG X，GU H，et al_Pathologic func-tion and therapeutic potential of exosomes in cardiovascular dis-ease EJl. Biochim Biophys Acta（BBA）-Molecular Basis Of Dis-ease， 2015， 1852（1）：1-11.

[3] HEMLER M E.Tetraspanin Proteins Mediate Cellular Pen-etration， Invasion， and Fusion Events and Define a Novel Typeof Membrane Microdomain [J] Annu Rev Cell Dev Biol， 2003，19： 397-422.

[4] VALADI H，EKSTROM K，BOSSIOS A，et al_Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mecha-nism of genetic exchange between cells [J]. Nature Cell Biolo-gy， 2007， 9（6） ： 654-659.

[5] MELO S A， LUECKE L B， KAHLERT C， et al. Glypi-can- I identifies cancer exosomes and detects early pancreaticcancer [J]. Nature， 2015， 523（7559）： 177-182.

[6] ZHAO Q， DENG S， WANG G， et al. A direct quantifica-tion method for measuring plasma MicroRNAs identified poten-tial bioruarkers for detecting metastatic breast cancer [J]. Onco-target， 2016， 7（16）： 21865-21874.

[7] SKOTLAND T， EKROOS K， KAUHANEN D， et al. Mo-lecular lipid species in urmary exosomes as potential prostatecancer biomarkers [J]. European Journal of Cancer， 2017， 70：122-132.

[8] KIM M S， HANEY M J， ZHAO Y， et al. EngineeringMacrophage-derived Exosorues for Targeted Paclitaxel Deliveryto Pulmonary Metastases： in vitro and in vivo Evaluations [J].Nanoruedicine， 2018， 14（ 1） ： 195-204.

[9] O' BRIEN K P， KHAN S， GILLIGAN K E， et al. Em-ploying mesenchymal stem cells to support tumor-targeted deliv-ery of extracellular vesicle （EV）-encapsulated microRNA-379[J]. Oncogene， 2018，37（16） ： 2137-2149.

[10] KATSUDA T， TSUCHIYA R， KOSAKA N， et al. Hu-man adipose tissue- derived ruesenchymal stem cells secretefunctional neprilysin- bound exosomes [J]. Scientific Reports，2013 ， 3（1197） ：1197.