血府逐瘀湯促進(jìn)大鼠隨意皮瓣存活的療效

劉煥興，蔡仲卿，沈新升，陳作喜

（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 骨傷科，浙江 溫州 325000）

隨意皮瓣沒有軸心血管的限制，取皮的位置及方向較其他類型皮瓣更加靈活，因此被廣泛應(yīng)用于整形、創(chuàng)傷、手顯微外科等多種臨床手術(shù)的組織修復(fù)重建[1-2]。也由于隨意皮瓣內(nèi)沒有知名血管走行，其血運(yùn)主要依靠蒂部的微血管網(wǎng)供血，所以隨意皮瓣血運(yùn)較差，容易發(fā)生皮瓣缺血性壞死。特別是當(dāng)皮瓣長寬比超過2:1時(shí)，皮瓣遠(yuǎn)端極易發(fā)生壞死。這極大影響了隨意皮瓣的臨床應(yīng)用及其臨床療效。因此，尋找可以促進(jìn)隨意皮瓣存活、增加皮瓣血運(yùn)、減少皮瓣壞死面積的方法具有重要臨床意義?，F(xiàn)有研究表明，中醫(yī)活血化瘀的方法有促進(jìn)微循環(huán)、改善血運(yùn)的作用[3]。中醫(yī)行氣活血的方劑中，血府逐瘀湯應(yīng)用較廣，且有研究表明其具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功效[4-5]。但是血府逐瘀湯能夠促進(jìn)隨意皮瓣存活尚未可知，本研究分析了該方對(duì)大鼠隨意皮瓣存活的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量200～250 g，由上海斯萊克動(dòng)物公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，合格證號(hào)：2007-000548429。所有動(dòng)物在溫度為（24±0.5）℃，濕度為45%～50%，通風(fēng)良好的環(huán)境下飼養(yǎng)。為減少實(shí)驗(yàn)誤差，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由同一名醫(yī)師操作。

1.1.2 藥物與試劑：血府逐瘀湯：當(dāng)歸9 g，生地9 g，桃仁12 g，紅花9 g，枳殼6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗6 g，川穹6 g，牛膝9 g，由溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。將藥材用蒸餾水浸泡1 h，水煎2次后過濾取液，煎液加熱濃縮至含生藥量1.3 g/mL，熬制完畢，放入蒸汽滅菌鍋中滅菌，后置于4℃冰箱保存?？勾笫笱軆?nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體購自美國Proteintech公司，兔二抗購自北京中杉金橋公司，BCA試劑盒購自美國Thermo Fisher科技公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備及分組：采用改良的McFarlane模型[6-7]建立大鼠隨意皮瓣：4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠俯臥位固定，剃除背部毛發(fā)，消毒鋪巾，以大鼠兩髂嵴連線作為皮瓣蒂部，向頭端方向在背部正中建立隨意皮瓣（9 cm×3 cm），切開皮膚及皮下組織，達(dá)深筋膜，分離皮下組織，掀起皮瓣，結(jié)扎知名血管后，以醫(yī)用慕絲縫線間斷縫合，創(chuàng)口周圍消毒，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由同一名醫(yī)師操作。將建立模型的大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為4組，每組18只，根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道選擇用藥濃度，相應(yīng)用藥方案如下[8]：①對(duì)照組：0.9%氯化鈉溶液10 mL·kg-1·d-1灌胃；②血府逐瘀湯高劑量組（高劑量組）：生藥13 g·kg-1·d-1灌胃；③血府逐瘀湯中劑量組（中劑量組）：生藥6.5 g·kg-1·d-1灌胃；④血府逐瘀湯低劑量組（低劑量組）：生藥3.25 g·kg-1·d-1灌胃。

1.2.2 標(biāo)本采集：大鼠造模術(shù)后連續(xù)給藥7 d，每天于8：00及17：00給藥。7 d后以10%戊巴比妥鈉過量腹腔注射處死大鼠，沿皮瓣中軸線將皮瓣三等分：蒂部（I區(qū)），中部（II區(qū)），頭部（III區(qū)），切取II區(qū)中心位置的組織標(biāo)本（0.5 cm×0.5 cm）。

1.2.3 皮瓣存活面積比測(cè)量：術(shù)后1～7 d，每日觀察皮瓣存活情況并記錄。皮瓣顏色發(fā)黑、干硬、無毛發(fā)生長，考慮為皮瓣壞死；皮瓣顏色紅潤、柔軟、新鮮毛發(fā)生長，考慮皮瓣存活。第7天，大鼠在麻醉狀態(tài)下，沿皮瓣中軸線測(cè)量存活皮瓣存活面積并記錄。采用照片軟件掃描法測(cè)量皮瓣存活面積，拍攝第7天大鼠處死前的皮瓣照片，通過電腦掃描后，用Image J軟件勾勒皮瓣存活面積并計(jì)算。皮瓣存活面積比=（存活的皮瓣面積/總皮瓣面積）×100%。

1.2.4 組織學(xué)檢測(cè)：皮瓣術(shù)后第7天，取II區(qū)皮瓣標(biāo)本浸泡于4%多聚甲醛中固定1 d，石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片，HE染色。200倍光學(xué)顯微鏡下觀察皮瓣的肉芽組織生長、皮瓣水腫、炎性浸潤、血管新生等情況。每個(gè)組織隨機(jī)挑選6個(gè)視野計(jì)數(shù)微血管橫斷面數(shù)目，計(jì)算平均數(shù)并換算為單位面積（/mm2）下的皮瓣微血管數(shù)，即微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)：術(shù)后7 d，取II區(qū)皮瓣標(biāo)本，研磨勻漿，用BCA試劑檢測(cè)蛋白濃度并配平，進(jìn)行Western blot法檢測(cè)四組標(biāo)本內(nèi)的VEGF表達(dá)量（抗大鼠VEGF濃度1:1 000，兔二抗1:10 000）。條帶用Image Lab 3.0軟件定量檢測(cè)。

1.2.6 SOD、MDA表達(dá)的檢測(cè)：術(shù)后7 d，取皮瓣II區(qū)標(biāo)本，稱取等量標(biāo)本，在冰水浴中制成體積分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿液，3 500 r/min離心15 min后取上清液，按照SOD、MDA檢測(cè)試劑盒說明書，檢測(cè)各組標(biāo)本中的SOD、MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)及低劑量組（P=0.019），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)采用±s表示，對(duì)照組和各劑量組間的皮瓣存活面積、血管密度、VEGF表達(dá)量、SOD及MDA含量采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量組血府逐瘀湯對(duì)大鼠皮瓣存活面積比的影響 皮瓣術(shù)后第1天起，4組大鼠的皮瓣都出現(xiàn)不同程度的水腫，遠(yuǎn)端呈現(xiàn)暗紅色，但未出現(xiàn)明顯壞死。隨后數(shù)天內(nèi)，各組遠(yuǎn)端皮膚開始出現(xiàn)不同程度壞死，皮膚逐漸發(fā)黑、干硬、皺縮，甚至出現(xiàn)結(jié)痂，壞死組織逐漸向皮瓣蒂部發(fā)展，而各組的蒂部皮瓣皮膚皮膚紅潤、柔軟。術(shù)后第7天，壞死與存活的皮瓣組織之間的界限逐漸穩(wěn)定。血府逐瘀湯低劑量組（P=0.004）、中劑量組（P＜0.001）、高劑量組（P=0.007）的皮瓣存活面積比明顯高于對(duì)照組，其中中劑量組的存活面積比優(yōu)于高劑量組（P=0.043）

圖1 各組大鼠皮瓣存活面積比

2.2 不同劑量組血府逐瘀湯對(duì)大鼠皮瓣微血管生長的影響 術(shù)后第7天，大鼠II區(qū)皮瓣出現(xiàn)炎性浸潤、組織水腫、血管新生，見圖2。其中，相較于對(duì)照組的MVD值，低劑量組、中劑量組、高劑量組明顯有更多的微血管生長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。不同劑量組間的比較：中劑量組的MVD較低劑量組、高劑量組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），余二組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.326），見圖3。

圖2 各組大鼠皮瓣皮下組織的HE染色結(jié)果（×200）

圖3 各組大鼠皮瓣皮下組織的MVD

2.3 不同劑量組血府逐瘀湯對(duì)皮瓣組織VEGF表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，血府逐瘀湯低劑量組（P=0.048）、中劑量組（P＜0.001）、高劑量組（P＜0.001）的VEGF表達(dá)量均存在顯著差異。中劑量組VEGF表達(dá)量顯著高于低劑量組（P=0.004）、高劑量組（P=0.048），高劑量組與低劑量組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029），見圖4。

2.4 不同劑量組血府逐瘀湯對(duì)皮瓣組織SOD、MDA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比，低劑量組（P=0.017）、中劑量組（P=0.026）、高劑量組（P=0.004）的SOD表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同劑量組之間的SOD表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組MDA表達(dá)量相比，低劑量組（P=0.026）、中劑量組（P=0.003）、高劑量組（P=0.004）的表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同劑量組之間的MDA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖4 各組大鼠皮瓣的VEGF相對(duì)光密度值

表1 各組大鼠皮瓣組織的SOD及MDA含量（每組n=6）

3 討論

隨意皮瓣遠(yuǎn)端容易發(fā)生缺血性壞死，目前認(rèn)為主要與隨意皮瓣血供不足有關(guān)[1-2，9]。皮瓣主要依賴于皮瓣蒂部的微血管網(wǎng)供血，待蒂部微血管網(wǎng)的新生血管向皮瓣遠(yuǎn)端生長，遠(yuǎn)端皮瓣的缺血組織內(nèi)微循環(huán)重建后，皮瓣才能依賴其血供存活[10-11]。因此，血管新生對(duì)隨意皮瓣存活具有重要意義。同時(shí)，皮瓣組織缺血后血流再通，會(huì)引起缺血再灌注損傷，這對(duì)皮瓣存活也有重要影響。

血府逐瘀湯具有活血袪瘀、行氣止痛的功效，在中醫(yī)行氣活血法中應(yīng)用較廣。當(dāng)前文獻(xiàn)已表明，血府逐瘀湯能改善微循環(huán)，促進(jìn)血液循環(huán)[12]，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示了血府逐瘀湯可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)VEGF表達(dá)[13]。因此我們將血府逐瘀湯應(yīng)用于隨意皮瓣大鼠模型，檢測(cè)其療效及相關(guān)機(jī)制。

本研究結(jié)果中，血府逐瘀湯不同劑量組的大鼠皮瓣大體存活面積均較對(duì)照組明顯改善，而不同劑量組內(nèi)的比較表明中劑量組的治療效果最佳。通過組織學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各藥物治療組的組織內(nèi)的微血管數(shù)量明顯多于對(duì)照組，而中劑量的微血管數(shù)量在各劑量組中最多，提示血府逐瘀湯確實(shí)可以促進(jìn)大鼠隨意皮瓣的存活，其治療效果可能是通過促進(jìn)缺血組織內(nèi)的微血管生長，改善微循環(huán)實(shí)現(xiàn)的，而中劑量組的治療效果相較而言是其中最佳的。高劑量組的治療效果反而不如中劑量組，我們猜測(cè)可能的原因，一是該藥劑有活血化瘀的功效，劑量過高可能會(huì)引起凝血功能異常，影響皮瓣愈合，出血血腫也會(huì)影響新生血管的發(fā)生；二是過高劑量的中藥可能會(huì)引起肝腎功能損害。另外，根據(jù)文獻(xiàn)，血府逐瘀湯用于人體的常規(guī)劑量與中劑量組相近，高劑量組劑量加倍，可能劑量過高引起了不良反應(yīng)[14]。

新生血管生成與缺血組織內(nèi)微循環(huán)的重建密切相關(guān)，因此，血管新生對(duì)改善組織缺血、促進(jìn)皮瓣存活至關(guān)重要。血管新生主要分為以下步驟：原細(xì)胞連接破壞，血管內(nèi)皮細(xì)胞分化增值，出芽，新生血管成熟[15]。研究表明，VEFG是血管新生的關(guān)鍵因子，其直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其有絲分裂及增殖分化[16]，從而促進(jìn)皮瓣內(nèi)的血管新生，增加缺血組織內(nèi)的微血管數(shù)量，加快皮瓣遠(yuǎn)端與蒂部及皮瓣與切緣之間的血運(yùn)重建，從而改善微循環(huán)，加快血運(yùn)重建。本研究表明，在皮瓣壞死區(qū)與存活區(qū)交界的II區(qū)，血府逐瘀湯治療組的MVD均增加，同時(shí)VEGF的陽性表達(dá)也增加，血府逐瘀湯可能是通過增加VEGF的表達(dá)來促進(jìn)皮瓣缺血組織的血管新生，從而改善皮瓣血運(yùn)的。其中，中劑量組相較高劑量組、低劑量組VEGF的表達(dá)量最高，同時(shí)局部MVD最大，提示中劑量組對(duì)通過VEGF促進(jìn)血管新生的療效最好。

當(dāng)缺血組織內(nèi)的微循環(huán)重建、血運(yùn)再通后，組織內(nèi)會(huì)發(fā)生缺血再灌注損傷，這是組織缺血后損傷壞死的重要因素[17]。缺血再灌注損傷中，氧自由基大量產(chǎn)生，與細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而破壞細(xì)胞。該過程中，MDA會(huì)作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物生成，因此其含量可以間接反映組織的缺血再灌注損傷程度[18]。SOD可通過歧化反應(yīng)清除超氧陰離子自由基，其中內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[19]。本研究證實(shí)，血府逐瘀湯可促進(jìn)內(nèi)源性SOD的活性或增加其表達(dá)量，并減少了MDA的表達(dá)，表明該方劑可促進(jìn)氧自由基清除、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減少皮瓣的缺血再灌注損傷。

綜上所述，本研究表明血府逐瘀湯可促進(jìn)大鼠隨意皮瓣的存活，其中，中劑量組治療效果最佳。其機(jī)制可能是通過促進(jìn)缺血組織內(nèi)的VEGF表達(dá)，從而增加組織內(nèi)的新生血管密度，促進(jìn)微循環(huán)重建，同時(shí)抑制組織的缺血再灌注損傷。