白血病抑制因子通過JAK1/STAT3信號通路調控非小細胞肺癌細胞活性

黃科峰，江明君，王華英，戚賽春

（寧波大學附屬人民醫院 心胸外科，浙江 寧波 315040）

肺癌是世界范圍內最常見的腫瘤，也是致死率最高的腫瘤之一，分為小細胞肺癌（13%）和非小細胞肺癌（87%，non-small cell lung cancer，NSCLC），5年總生存率僅18.2%[1]。目前臨床上主要治療方法為手術、化療、放療等，但肺癌發展到晚期后治療效果往往較差[2]。白血病抑制因子（leukemia inhibitor factor，LIF）是IL-6家族成員之一，在人類生殖、骨重塑、下丘腦-垂體-腎上腺軸、神經肌肉系統、心臟、造血系統、腫瘤等方面都有重要作用。LIF已在許多實體瘤中發現有表達，包括乳腺癌、皮膚癌、結直腸癌、鼻咽癌和肺癌，且LIF在體外刺激多種腫瘤的生長，抑制腫瘤細胞分化并誘導其轉移，但其作用特點及機制有待進一步明確[3-4]。本研究通過評價NSCLC患者手術切除標本和LIF干預肺腺癌A549細胞系，探討LIF在NSCLC病理過程中作用機制及特點。

1 材料和方法

1.1 材料 癌組織及癌旁組織均取自本院患者手術切除標本。CCK-8試劑盒、LIF抗體、磷酸化JAK1抗體、JAK1抗體、磷酸化STAT3抗體（美國Santa Cruz公司），GAPDH（美國CST公司），二抗（上海碧云天生物科技有限公司）；AB629細胞（中國科學院上海細胞庫）；胎牛血清、DMEM培養基（美國Hyclone公司）；反轉錄試劑盒、PCR試劑盒（美國Bio-Rad公司）；重組LIF（美國Chemicon公司）；Transwell小室套裝（美國Corning公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法觀察LIF蛋白表達：患者肺癌組織和癌旁組織脫水、石蠟包埋后切片，脫蠟后用蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min后進行抗原修復，用3%過氧化氫室溫孵育5～10 min后，PBS沖洗3遍，每次 2 min。10%山羊血清封閉后，室溫孵育10 min后傾去血清，滴加對應的一抗，37℃孵育2 h后4℃過夜。第2天PBS沖洗3遍，每次2 min，滴加對應的二抗，37℃孵育2 h，PBS沖洗3遍，每次2 min。用顯色劑顯色，PBS沖洗，復染，梯度乙醇脫水后用二甲苯透明，中性樹膠封片。常規顯微鏡下隨機10個視野條件下，記錄棕色陽性細胞數。

1.2.2 RT-qPCR檢測LIF mRNA表達：取NSCLC患者手術切除的癌組織和癌旁組織勻漿，加入1 mL細胞裂解液，提取組織總RNA。使用RNA反轉錄試劑盒將RNA轉錄成為cDNA。反應條件為：37℃，15 min；98℃，5 min。FQ-PCR反應體系：2×SYBR Premix Ex Taq TMI II Mix 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL，dd H2O 8 μL，總體積為20 μL。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 15 s；72℃ 20 s；擴增40個循環。擴增結束后，采用ΔΔCT分析結果。引物序列LIF-F：CCTCTTCCCATCACCCCTGTAAGAAGG，LIF-R：CCTGGACCACCACACT；GAPDH-F：TCATCACTATTG GCAACGAGC，GAPDH-R：AACAGTCCGCCTAGAAGCAC。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖：取生長狀態良好的A549細胞制備成1×105/mL的細胞懸液，每孔100 μL 加入96孔細胞培養板中置于培養箱內37℃、5% CO2條件預孵育24 h后，各孔隨機分為以下4組：A549細胞對照組（LIF空白溶劑），LIF干預A549細胞組（50、100、150 ng/mL LIF）每組設5個副孔。繼續孵育12 h后向每孔加入10 μL CCK-8工作液，繼續在培養箱中孵育2 h。采用雙波長測定吸光度，檢測波長450 nm，參比波長600 nm，讀取各孔OD值，以OD值間接反映細胞增殖狀況。同法培養細胞至加入CCK-8工作液前，棄去培養基，PBS洗滌后用裂解液裂解各孔細胞，BCA法蛋白定量后加入Loading Buffer，100℃煮10 min蛋白變性，樣本-80℃保存待用。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞侵襲：Transwell小室均勻涂布基底膜基質（1 mg/mL）后于37℃孵育0.5 h，分別吸取1×105個細胞接種至上室，并將各小室分為以下4組：A549細胞對照組（LIF空白溶劑），LIF干預A549細胞組（50、100、150 ng/mL LIF），每組設3個副孔；各小室下室加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。上述小室內蓋住后置于培養箱內37℃、5% CO2條件培養48 h后，將濾膜用多聚甲醛固定后拭去表面細胞，Giemsa染色后隨機選擇10個不同視野記錄細胞數。

1.2.5 Western blot檢測LIF蛋白表達：配制10%聚丙烯酰胺凝膠，固定于電泳槽后，以30 μg/孔注于泳道中開啟電泳，濕法轉模結束后用5%牛奶封閉1 h，用對應的一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入對應的二抗，常溫孵育1 h后，洗膜。條帶浸淋增強化學發光試劑后用化學發光顯影儀顯影。結果以各泳道GAPDH灰度值作為參考，目的條帶與其灰度值的相對值進行組間比較。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS12.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間差異采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 NSCLC患者癌旁組織（A）和癌組織（B）LIF陽性表達（棕色顆粒為LIF陽性表達細胞）（×400）

2.1 LIF在人NSCLC癌變組織中的表達 圖1免疫組化結果顯示，NSCLC患者的肺癌組織中LIF陽性表達率明顯偏高，且分布較為廣泛，提示較大范圍和高水平的LIF組織表達。PCR結果顯示NSCLC癌組織中LIF mRNA的表達明顯高于非病變組織，Western blot結果顯示NSCLC患者癌組織的LIF蛋白表達水平明顯增高，見圖2。

圖2 LIF mRNA（A）和蛋白（B）在NSCLC患者癌組織和癌旁組織中的表達

2.2 重組LIF對A549細胞增殖的影響 結果顯示100、150 ng/mL LIF處理48 h可促使A549細胞活力明顯增強（P＜0.05），見圖3。

圖3 LIF孵育48 h促進A549細胞增殖

2.3 重組LIF對A549細胞侵襲的影響 A549細胞經重組LIF處理48 h后，A549細胞通過其自身遷移能力通過基底膜的細胞數目越多提示細胞侵襲能力越強。經100、150 ng/mL LIF處理后的A549細胞通過基底膜的細胞數顯著多于未經LIF處理的細胞（P＜0.05），見圖4。

圖4 LIF孵育48 h促進A549細胞遷移

2.4 LIF對A549細胞JAK1/STAT3通路的影響 A549細胞經重組LIF處理后，細胞中JAK1磷酸化水平顯著提高，其下游重要的分子STAT3磷酸化水平也明顯提高（P＜0.05），見圖5。

3 討論

LIF最初被克隆出來時被視為髓樣白血病細胞系（M1）的分化誘導物和增殖抑制劑[5]。作為IL-6家族成員，與其他IL-6家族細胞因子類似，LIF以緊湊的四螺旋束形式存在，其分子構型極為穩定，為其發揮生理作用創造了有利條件。LIF和其受體已在許多實體瘤中發現有表達，包括乳腺癌、皮膚結直腸癌和鼻咽癌[6]。體外實驗已經證明了這些癌細胞上高LIF水平與腫瘤復發和放射抵抗以及LIF誘導的放射抵抗和DNA修復抑制有關[7]，然而其在NSCLC患者組織上的表達研究較少。

本研究發現，LIF在NSCLC細胞A549中持續較高水平表達，活化水平亦高。LIF可通過促進NSCLC相關癌細胞的增殖、侵襲作用促進癌細胞活化，可能的作用機制是通過活化JAK1/STAT3信號通路。

JAK/STAT信號通路與肺癌關系密切，尤其是JAK/STAT1、JAK/STAT3、JAK/STAT5是該信號通路幾條參與肺癌作用的經典通路，其中JAK1/STAT3信號通路在肺癌中研究較多[8-9]。在一項對NSCLC的研究中發現，列入研究的10例NSCLC患者全部出現STAT3的高度磷酸化[10-11]，另外擴大樣本檢測發現，約有55%的NSCLC患者及大多數NSCLC相關細胞系都發現了STAT3的異常活化。說明STAT3A的高度活化與NSCLC密切相關[12]。

細胞膜上相關受體一旦被LIF激活，受體結合的JAK1最初將LIF受體胞內域上的酪氨酸靶向磷酸化。磷酸化的受體鏈（gp130和LIF-Rβ）充當支架以募集許多信號轉導實體，其中最重要的可能是STAT3。STAT蛋白是轉錄因子家族，通常以非活性狀態存在于細胞質中[13]。STAT3一旦募集到相關效應分子，其自身就會被JAK1磷酸化，這一激活步驟使其形成具有信號功能的二聚體[14]，該二聚體易位進入細胞核并上調適當的細胞因子反應性基因的轉錄。本研究發現LIF促進A549細胞的過度活化是通過JAK/STAT信號通路中JAK1/STAT3所實現的，但具體機制尚不明確。下一步將進一步明確LIF作用JAK1/STAT3信號后的相互作用及信號間的聯系特征。

圖5 Western blot檢測A549細胞經不同濃度LIF干預后JAK1和STAT3表達情況

綜上，NSCLC患者腫瘤組織存在LIF過表達現象，過表達的LIF可通過JAK1/STAT3信號促進肺癌細胞的增殖和遷移（侵襲），從而促進該病病程的發展。LIF可能作為一個重要靶點干預NSCLC的疾病進程。