非編碼RNA 與冠狀動脈支架內再狹窄的研究進展

徐超，楚天舒

（昆明醫科大學第二附屬醫院心內科二病區，云南 昆明）

0 引言

冠心病嚴重威脅人類生命、健康，具有高死亡率和高致殘率。我國冠心病患病率處于持續上升階段，帶來了沉重的社會及經濟負擔。據《中國心血管病報告2018（概要）》數據顯示全國冠心病患者1100 萬，2017 年冠狀動脈經皮介入治療數超過75 萬例[1]。經皮冠狀動脈介入治療( percutaneous coronary intervention，PCI) 是冠狀動脈血管重建治療的轉折點，顯著改善冠心病患者預后，成為冠心病最有效的治療手段。但 PCI 術后存在支架內再狹窄(instent restenosis，ISR) ，嚴重限制其臨床療效。據統計裸金屬支架植入術后ISR 的臨床發生率約為20%-35%，藥物洗脫支架的使用使ISR 的發生率降低到5%-10%[2,3]，如何預防及治療ISR 是當前心血管領域亟待解決的問題。血管損傷及修復、血管重塑是ISR的重要機制。基因在疾病的發生、發展過程中起到了重要的地位，研究表明非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）在血管損傷及修復、血管重塑等血管疾病的發生、發展過程中發揮表觀遺傳調控作用，本文對 ncRNA 與ISR 相關機制進行綜述，ncRNA 的測定及靶向治療可能為ISR 防治提供新的思路和策略。

1 概述

ISR 發生于冠狀動脈粥樣硬化患者冠狀動脈成形術與支架植入術后，冠脈支架全程和/ 或兩端5 mm 節段內管腔丟失，冠脈造影發現管腔狹窄≥50%，或血管內成像發現新出現的支架內管腔≥75% 的狹窄并伴見相對應的心肌缺血臨床表現[4]。血管成形術或支架植入導致病變血管內皮細胞破壞、內部彈性纖維層斷裂，支架作為外源性物質，通過促進炎癥反應、免疫反應、血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和植入后新內膜的形成等引起ISR 和晚期血栓形成。在動物模型和患者中觀察到再狹窄過程包括彈性回縮、血栓、新內膜的形成和的血管重塑[5]。血管機械拉伸導致內皮細胞（endothelial cells，ECs）剝脫，ECs、炎癥細胞和血小板釋放各種細胞因子促進新生內膜層血管VSMCs 和成纖維細胞發生遷移和增殖，導致內膜增生及血管重塑[6]。藥物洗脫支架雖有效抑制VSMCs 的增殖和遷移，但抑制損傷血管內膜內皮化，內皮下膠原長時間暴露亦可導致晚期血栓形成[7]。可見VSMCs 和ECs 失衡在血管損傷及修復、血管重塑等血管疾病中起到關鍵作用，是導致ISR的重要機制。

目前研究表明，人類大約只有2% 的基因組負責編碼蛋白質， ncRNA 來源于“非編碼”基因組區域轉錄而來的異質類RNA 分子[8]。根據鏈的長短，主要分為小分子ncRNA(＜200bp)和 長 分 子ncRNA（＞200bp），前 者 包 括miRNA（microRNA）、siRNA（small interfering RNA）、snRNA（small nuclear RNA）、piRNA（piwi-interacting RNA）、tRNA（transfer RNA），后 者 包括rRNA（ribosomal RNA）、自然反義轉錄子、lncRNA（long noncoding RNA）[9]。大量研究表明ncRNA 是機體代謝、發育和分化等各種生理和生物學反應的重要介質，與機體的某些病理狀態有關，ncRNA 在血管功能障礙、再內皮化和血管再狹窄中發揮重要作用，ISR 與ncRNA 的失調密切相關，本文主要集中討論研究較多的三類ncRNA：miRNA、lncRNA、siRNA 基因表達中起調控作用與ISR 的關系。

2 miRNA 與ISR

目前對miRNA 的研究較為廣泛，miRNA 由18-22 個核苷酸組成，在3’- 非翻譯區(3'-UTRs) 與靶基因結合，導致信使RNA的直接降解或通過補體進行翻譯抑制，從而能夠調節基因的表達[10]，大量miRNA 被確認為多種疾病中基因表達的重要轉錄后調控因子，可作為心血管疾病的生物標志物[11]。在ISR 的發生、發展中，miRNA 對VSMCs 及ECs 功能調節上具有關鍵性作用。

Ji 等[12]首次利用miRNA 陣列測定大鼠球囊損傷后頸動脈miRNA 譜，在新生內膜病變中測定到miR-21 的異常過表達，miR-21 通過直接靶向作用于磷酸酶和Tensin 同源蛋白促進VSMCs 的增殖，后者是VSMCs 體內和體外功能的關鍵調控因子。血管造影證實的ISR 患者體內miR-21 循環水平明顯高于對照組，支持了miR-21 的調節在人類臨床中具有相關性的觀點[13]。Wang 等[14]人使用anti-miR-21 涂層支架測試局部遞送miR-21抑制劑對損傷動脈的影響，證明anti-miR-21 涂層支架在不影響再內皮化的情況下顯著減少支架內再狹窄。miR-143 和miR-145被認為是血管發育和血管疾病中VSMCs 表型開關的主要調控因子[15]，miR-145 和miR-143 基因組消融可導致小鼠VSMCs 分化不完全，在控制VSMCs 足突形成中發揮作用[16]。臨床證據顯示，miR-143 循環水平能夠預測ISR 發生，miR-143/miR-145 強烈參與新生內膜形成的分子機制[13]。研究發現miR-22 在受損股動脈中下調，通過靶向結合甲基蛋白、組蛋白去乙酰化酶和回歸病毒整合位點蛋白同源物的3'UTR，過表達可降低VSMCs 的增殖，抑制損傷股動脈的新生內膜形成[17]。在大鼠模型中，觀察到球囊損傷頸動脈組miR-133 水平降低[18]，miR-133 表達降低VSMCs 的增殖和遷移，腺病毒介導的miR-133 過表達可減弱球囊損傷后的新生內膜形成，而抑制其內源性水平則可誘導相反的效果，冠狀動脈miR-133a 濃度梯度的降低預示著ISR 率更高[19]。miR-195 表達限制VSMCs 增殖、遷移，在周圍動脈疾病患者支架植入術2 年后，miR-195 循環水平是靶血管重建的獨立預測因子[20]。miR-9、miR-23b、miR-559 和miR-663 介導抑制血管增生疾病進的一步例子，此外，miR-125b、miR-130a、miR-146a、miR-210 等其他miRNA 也參與調控VSMC 功能[21]。特別是miR-21、miR-100、miR-143 和miR-145 的循環水平與藥物支架植入后ISR 的發生有關，在ISR 患者循環中，miR-21 水平隨著miR-100、miR-143和miR-145 水平的降低而顯著升高。

ECs 具有維持血管正常生理功能、調節血管對剪切應力變化的反應重要作用，血管破裂區域的不完全覆蓋是動脈粥樣硬化和晚期血栓形成的主要原因，支架置入后腔內ECs 的快速再生可預防ISR 和血栓形成[22]。miRNA 對ECs 具有潛在的調控作用。ECs 表達中miR-126 量最高，它參與炎癥反應和內皮功能的調節[23]。在小鼠模型中，miR-126 缺失使受損動脈ECs 再生障礙，導致血管完整性喪失和血管生成減少[24]。動脈粥樣硬化的早期階段炎癥細胞因子高表達，miR- 126 具有調節血管內皮生長因子和腫瘤壞死因子功能，主要信號通路包括通過抑制SPRED-1（出芽相關蛋白sprout-related protein）和PIK3R2（2 磷酸肌醇3 激 酶 調 節 亞 基2phosphoinositol-3 nase regulatory subunit）、以及 VCAM-1（血管細胞粘附蛋白1Vascular cell adhesion molecule 1）高表達[23,25]。miR-126 通過調節ECs 對脂質的反應改變ECs的轉化率發揮保護作用[26]，過表達促進ECs 增殖來預防動脈粥樣硬化。miR-17/92a 被認為是另一個關鍵調控因子，在冠狀動脈搭橋手術患者、缺血和血管損傷的動物模型中，其水平均升高[27]。miR-221/222 在體外抑制ECs 增殖和遷移，抑制新生血管形成[28]。最近研究表明miR-222 通過內皮衍生的微顆粒傳遞，遠程調節細胞內粘附分子的表達，參與細胞間信號轉導[29]。

綜上所述，不同的miRNA 在調解VSMCs、ECs 功能相關的分子和通路中起到表觀調控作用，可以作為ISR 的重要早期標志物，對miRNA 的調控可能對ISR 具有治療潛力。

3 lncRNA 與ISR

近年來lncRNA 的生物學功能引起了人們的廣泛關注。 LncRNA 是一大類由RNA 聚合酶II 轉錄、異構級不同的RNA 分子，鏈長大于200 個核苷酸。lncRNA 對基因調控的各個方面都有重要作用，如染色質重構、RNA 轉錄、選擇性剪接等[30]。由于lncRNA 具有與DNA、RNA 和蛋白質靶點相互作用的能力，在細胞增殖、遷移、凋亡、分化和發育中發揮關鍵作用。lncRNA 功能和表達的改變可以導致多種人類病理過程，越來越多的證據表明lncRNA 在血管重構等疾病中起到關鍵性的作用。

最早的研究發現lncRNA 在大鼠模型中通過介導Ang II 信號通路導致表達顯著改變，在VSMCs 增殖和內膜病變發展中起到重要作用[31]。lncR ANRIL 的下調可增強CDKN2A/B（細胞周期依賴性激酶抑制基因）的表達，抑制VSMCs 增殖，該基因位點與以血管形成改變或重構為特征的疾病相關[32]。Tang 等[33]發現VSMC 分化期lncR Gas5 作用于TGF-β/ Smad3（transforming growth factor β1，TGF-β1）信號通路，抑制Gas5 表達導致VSMC分化下調。lncR-p21 的下調p53 的活性抑制VSMCs 增殖[34]；lncR MEG3 可影響VSMCs 生存和遷移[35]；LncR-AK098656 表達上調細胞外基質蛋白、降低了收縮蛋白水平、促進VSMCs 的增殖和遷移，AK098656 轉基因大鼠出現自發性高血壓、VSMCs 合成表達升高、動脈狹窄[36]；lncR-RNCR3 在小鼠和人類主動脈粥樣硬化病變中上調，RNCR3 的下調降低了ECs 和VSMCs 在體外的增殖、遷移，加速了細胞凋亡的發生，RNCR3 具有動脈粥樣硬化保護作用，可用于動脈粥樣硬化相關血管疾病的治療[37]。

此外，研究發現LncR ATG9B 在ECs 表達中富集，ATG9B 是一種反義lncRNA，與內皮型一氧化氮合酶（NOS3 或eNOS）基因部分重疊，在正常情況下ECs 中的表達較低，在缺氧后表達上調，ATG9B 能夠下調eNOS 的表達減少一氧化氮的生成，一氧化氮具有抗動脈粥樣硬化和抗血栓形成的特性[38]。另一類個反義lncR HIF-1AS 在不同的人體組織中表達，在急性心肌梗死患者中表達上調，HIF1A-AS1 促進ECs 增殖和減少凋亡[39]。LncRNA MALAT1 在內皮細胞中高度表達，與內皮細胞功能、炎癥過程和血管生成密切相關[40]。同時發現lncRNA 與miRNA 之間的相互作用調節ECs 功能，LncRNA-p21 通過調控mirna - 13038 促進ECs的增殖和抑制細胞凋亡[41]。

總之，隨著研究進展不斷深入，lncRNA 在調控VSMCs 的表型、ECs 的增殖與凋亡等功能逐漸被人們知曉，lncRNA 在ISR 生物學機制中起到關鍵作用，為ISR 靶點治療提供新的希望。

4 siRNA

siRNA 是一類長度為20-25 個核苷酸的雙鏈RNA，通過與mRNA 結合并促進其降解來抑制特定mRNA 的翻譯。雖然內源性siRNAs 在極少數哺乳動物中被發現，但它們可以通過多種轉染途徑被導入動物的細胞中，并能有效地產生靶向基因的特異性敲除。因此，siRNA 是研究基因功能和藥物靶點的重要工具。近年來，它也被認為是治療再狹窄的治療策略之一。

整合素在細胞黏附和遷移中起著重要作用，Kindlin-2 是整合素聚集和激活的關鍵成分，因此，可以通過調節整合素來抑制VSMC 的活化和遷移[42]。Wnt 信號通路在VSMC 的細胞增殖、遷移、粘附和存活過程中起著不可或缺的作用[43]。利用siRNA 抑制Kindlin-2 可以阻斷Wnt 信號，抑制VSMC 的增殖和遷移[44]。間質相互作用分子1 (STIM1)促進生長因子誘導的VSMCs 增殖，而siRNA 抑制STIM1 可減弱冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）增殖。此外，在頸動脈成形術動物模型中，特異性RNA 干擾沉默STIM1也可抑制再狹窄[45]。雖然這些結果還沒有在臨床實驗中得到證實，但為siRNA 預防支架植入后再狹窄提供了新方向。

5 ncRNA 在ISR 中臨床展望

近年來，ncRNA 從實驗室到臨床的轉化備受關注，在動物實驗或臨床試驗中，預防血管細胞增殖、內膜增生和ISR 方面表現出較好的效果，具有很大的應用潛力。隨著ncRNA 檢測、分析方法的不斷改進，新技術的開發應用，在將來可以實現無標簽、可靠、廉價和快速的檢測方法，進一步推動臨床研究，循環ncRNA 作為診斷性生物標志物。尤其是ncRNA 作為臨床生物標志物具有特殊的優勢：能夠反映了細胞內生物過程的狀態，對跟蹤某一疾病背后的特定生物學過程或對某一特定疾病、臨床綜合征的病因診斷、治療和預后有明顯影響。在支架植入前，可通過ncRNA 對ISR 風險進行預測，判斷患者ISR 的風險高低，為選擇更為精準的治療方案提供可靠指導。

同時，為克服藥物洗脫支架ISR 限制，提出基因洗脫支架設想，該支架不僅可以傳遞抗炎、抗血栓藥物，還可以攜帶miRNA、siRNA 等ncRNA。通過使用覆蓋ncRNAs 的支架控制易感區域基因的表達來限制ISR 的形成和發展，從而達到更好的預防、治療作用。為證明這一觀點，Akt1 siRNA 涂層支架的第一階段臨床試驗已被證明對ISR 有效，通過AKT1 siRNA 持續釋放到支架附近的位置，從而抑制VSMCs 的增殖并防止再狹窄[46]。ncRNA 洗脫涂層支架可能是避免植入后心血管損傷患者再狹窄的最有效策略。盡管ncRNA 在動物模型和臨床試驗中顯示出潛在的益處，但關于ncRNA 在血管重構機制中所起作用的實驗證據是最近才積累起來的，ncRNA 生物學機制尚未完全清楚、是否會帶來基因副作用等問題需要進一步探索，此外，人類對心血管疾病的認識很有限，因此，在心血管疾病患者中植入ncRNA 支架仍有很長的路要走。