一株沙門菌裂解性噬菌體的分離鑒定與生物學特性研究

李帥華,易開放,楊影影,賀丹丹,潘玉善,苑 麗,胡功政

(河南農業大學 牧醫工程學院,河南 鄭州 450000)

沙門菌(Salmonella)屬于腸道致病菌,其感染人和動物后可引起傷寒、急性胃腸炎以及敗血癥等疾病,是全球范圍內引起食物中毒的常見病原菌之一[1]；同時沙門氏菌感染與食品種類繁多有關,其污染源從人類到食品加工設施不等[2]。目前沙門氏菌共有超過2600個血清型,在我國報道的已有292個[3]。沙門菌對畜牧養殖業產生了巨大的影響，已經在全球范圍內造成了巨大的經濟損失,并對公共衛生安全構成嚴重威脅。

以往由于過于依賴抗生素對沙門菌病進行治療與防控,以及抗生素長期的不合理使用及濫用,致使細菌耐藥性問題逐漸加劇,導致或誘導病原菌產生變異,甚至產生多重耐藥或泛耐藥的“超級細菌”。另外,抗生素的種類有限，且新抗生素的研發速度無法趕上細菌產生耐藥性的速度,有研究證實:一種新的抗生素從發現到應用至少需要5年時間,而細菌產生耐藥性一般僅需要2年時間[4],因此針對沙門菌防控的新策略和產品亟待研究。

噬菌體(bacteriophage, phage)是一種細菌性病毒,廣泛存在于自然界,是生物圈中最豐富的物種。噬菌體是細菌的天敵,能夠天然殺滅細菌,在細菌治療方面較抗生素具有不可比擬的優勢:嚴格的宿主特異性、增殖速度快、研發時間短、成本低、安全無污染等,使得噬菌體有望成為一種防控沙門菌的新型武器。本試驗以沙門菌SA209為宿主菌,分離得到了1株沙門菌噬菌體,并對其生物學特性進行了研究,以期為噬菌體抗菌制劑的開發提供理論依據，為沙門菌的防控提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 細菌菌株與樣品采集

宿主菌株SA209以及其它試驗所用菌株均由本實驗室保存,樣品采自河南省安陽市某規模化養豬場。

1.2 主要試劑及培養基

瓊脂糖、DNase I、RNase A(TaKaRa)、SM緩沖液(北京百奧萊博科技有限公司)、SS瓊脂、LB肉湯、LB瓊脂均購于北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.3 噬菌體的分離與鑒定

噬菌體的分離方法參照文獻[5]并有所改進。將適量的糞便樣品完全溶解在SM緩沖液中,室溫靜置8 h,以10000 r/min離心10 min；上清液用0.48 μm的一次性無菌過濾器過濾,再次以10000 r/min離心10 min,再用0.22 μm的一次性無菌過濾器過濾。污水樣品以10000 r/min離心10 min,上清液用0.22 μm的一次性無菌過濾器過濾,即獲得噬菌體原液。將5 mL噬菌體原液和20 mL宿主菌液混合,37 ℃培養過夜。在培養物中加入適量的氯仿，振蕩20 min,以10000 r/min離心10 min,上清液即為噬菌體溶液。

將宿主菌液均勻涂布在LB平板上,滴加10 μL噬菌體溶液,對照組滴加等量的無菌水,待平板干燥后置于37 ℃培養12 h,觀察是否出現噬菌斑。

1.4 噬菌體的純化與保存

通過雙瓊脂平板法純化噬菌體:將噬菌體溶液以10倍梯度稀釋5次；將200 μL細菌液和100 μL噬菌體溶液加入到5 mL半固體培養基中，混合均勻后倒在LB平板上,將平板干燥后,在37 ℃下培養12 h。在雙板上形成斑塊后,用無菌牙簽挑取形狀規整、大而透亮的單個噬菌斑,加入1 mL SM溶液,于4 ℃放置6 h。重復上述操作,將單個噬菌體重復純化5～7次,以獲得純化后的噬菌體。

在5 mL宿主細菌溶液中加入100 μL噬菌體純化液,在37 ℃靜置30 min。然后,將培養物在37 ℃恒溫搖床中培養6 h。加入50 μL氯仿,劇烈振動15 min,再以7000 r/min離心20 min。將噬菌體溶液與80%甘油溶液(甘油終濃度為30%)混合,在-80 ℃下長時間保存,或在4 ℃下適時保存，備用。

1.5 噬菌體的效價計算

取純化后的噬菌體溶液100 μL，加入900 μL SM緩沖溶液,以10倍梯度倍比稀釋6次,使用雙層平板法測定噬菌體的滴度,試驗重復3次，取平均值。計算公式為:噬菌體滴度(PFU/mL)=稀釋倍數×噬菌斑個數×10。

1.6 噬菌體核酸類型的鑒定

取純化后的噬菌體顆粒,參考《分子克隆實驗指南》中的λ噬菌體顆粒PEG沉淀提取法[7]制備噬菌體濃縮液,用Virus DNA/RNA Kit試劑盒提取噬菌體的基因組,用DNase I、RNase A進行酶溶鑒定。試驗組:12 μL基因組+2 μL DNase I/RNase A+6 μL ddH2O。對照組:12 μL基因組+8 μL ddH2O。于37 ℃恒溫金屬浴30 min,通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.7 最佳感染復數

感染復數(multiplicity of infection, MOI)是指初始感染時加入噬菌體的數量與宿主菌數量的比值,也稱感染倍數。本試驗設定0.001、0.01、0.1、1、10、100等6個不同的感染復數,將噬菌體純培養物和宿主菌按照不同感染復數的比例混合,補加液體LB培養基使各試管的總體積相同；將各試管置于37 ℃搖床上，以180 r/min振蕩4 h,離心取上清,適當稀釋后利用雙層平板法測定各個感染復數下噬菌體的效價,以確定噬菌體的最佳感染復數。

1.8 一步生長曲線

噬菌體的一步生長曲線是定量描述毒性噬菌體生長規律的實驗曲線。實驗方法參照文獻[8],將對數生長期的宿主菌液以5000 r/min離心10 min，棄上清，用新鮮的LB肉湯重懸菌液,將菌液濃度定值到109cfu/mL;按最佳感染復數加入相應的噬菌體量,在37 ℃下以180 r/min在搖床上培養15 min；再冰浴30 s,然后以10000 r/min離心10 min,用新鮮的LB肉湯洗滌兩次，除去未吸附的噬菌體;再用37 ℃預熱的LB肉湯進行重懸,然后置于37 ℃、220 r/min的搖床培養并開始計時;分別在培養0、5、10、20、30、......、150 min時取樣500 μL,冰浴30 s,于4 ℃下以10000 r/min的轉速離心10 min,收集上清液，測定噬菌體的滴度(PFU/mL)。以感染時間t為橫坐標,以噬菌體滴度為縱坐標,繪制一步生長曲線,得出噬菌體的潛伏期、裂解期,并計算裂解量，其計算公式為:裂解量=裂解末期噬菌體的滴度/感染初期的宿主菌濃度。

1.9 噬菌體的pH穩定性

用HCI和NaOH溶液調節SM緩沖液的pH值,設置其pH值梯度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。分別取各pH值的SM緩沖液0.9 mL和噬菌體純培養物0.1 mL于無菌的EP管中，混勻，于37 ℃恒溫水浴2 h。然后對各梯度的混合培養液取樣，稀釋后測定噬菌體的效價；設置3次平行實驗，求平均值。以pH值為橫坐標，以噬菌體的效價為縱坐標作圖。

1.10 噬菌體的熱穩定性

將適量的噬菌體純培養物分別靜置于40、50、60、70、80 ℃的恒溫水浴鍋內,開始計時,分別在20、40、60 min時取樣,測定不同溫度不同時刻的噬菌體滴度；設置3個平行實驗，計算平均值。以時間為橫坐標,以噬菌體的滴度為縱坐標作圖。

1.11 噬菌體的宿主譜初測

宿主譜測定采用點滴法:取100 μL測試菌液，將其均勻涂布在LB平板上,靜置干燥后,取20 μL噬菌體純培養物滴在平板的相應區域,待其晾干后于37 ℃倒置過夜培養。觀察是否有裂解斑,若有裂解斑出現則證明噬菌體可裂解此株菌。

2 結果與分析

2.1 噬菌體的分離純化

本研究從污水樣品中分離純化得到1株沙門菌噬菌體,將其命名為SA-1。采用雙層平板法純化該噬菌體,可見SA-1的噬菌斑呈圓形,大而透亮,直徑為3～5 mm,邊緣清晰,無暈環(如圖1)。

圖1 噬菌體SA-1的純化噬菌斑

2.2 噬菌體的效價測定

將噬菌體SA-1純化后,測定其效價，為1.15×1010PFU/mL。

2.3 噬菌體核酸酶切鑒定

如圖2所示:噬菌體SA-1基因組陰性對照組、RNase A酶溶組均有明亮的條帶,條帶大小、位置基本一致;只有DNase I酶溶組沒有條帶。說明噬菌體SA-1基因組對DNA酶敏感,可以被DNA酶溶解,由此可判定噬菌體SA-1基因組的核酸類型為DNA。

M: Marker; 1: SA-1陰性對照;2: DNase I酶溶組; 3: RNase A酶溶組。

2.4 最佳感染復數

由圖3可見,噬菌體SA-1在MOI=0.001時,噬菌體的滴度最高,達1.3×1012PFU/mL。因此,可確定噬菌體SA-1的最佳感染復數為0.001。

圖3 噬菌體SA-1的感染復數

2.5 一步生長曲線

由圖4可知：噬菌體SA-1在感染宿主菌后的10 min內效價變化不明顯,表明其潛伏期為10 min；在感染后10～30 min內噬菌體的效價急劇升高,在感染30 min之后趨于平穩,表明其裂解期時長為20 min,在30 min之后進入穩定期。根據裂解量的計算公式，可以計算出噬菌體SA-1的裂解量為108 PFU/cell。

圖4 噬菌體SA-1的一步生長曲線

2.6 噬菌體的pH穩定性

由圖5可知：噬菌體SA-1的效價在pH為2和12時為0,表明其不能生長；在pH為4～8時，其效價變化不明顯,而且維持在較高水平；在pH為8～11時,其效價稍微下降,但幅度較小,依然維持在較高的數量級。總體表明,噬菌體SA-1在較大的pH范圍內依然可以保持活性,說明其對酸堿有著良好的耐受性。

圖5 噬菌體SA-1的pH穩定性

2.7 噬菌體的熱穩定性

由圖6可知：噬菌體SA-1在40 ℃和50 ℃下,其效價隨著時間的增加而出現升高或降低的現象,但都維持在較高的數量級,說明其在40～50 ℃下能維持良好的活性;在60、70、80 ℃條件下,噬菌體的效價處于直線下降狀態,在20 min時其效價均為0,說明其在60～80 ℃的環境中會喪失活性。所以噬菌體SA-1的最適生長溫度為40～50 ℃。

圖6 噬菌體SA-1的熱穩定性

2.8 噬菌體的宿主譜初測

本次實驗采用點滴法測定噬菌體SA-1的宿主范圍。從實驗室保存菌株中選取30株菌株:沙門氏菌臨床分離株17株、大腸桿菌臨床分離株11株、沙門氏菌JS標準菌株，以及大腸桿菌ATCC25922標準菌株。研究發現：在JS和17株沙門菌臨床分離株中有7株對該噬菌體敏感；在ATCC25922標準菌株和11株大腸桿菌臨床分離株中有4株對該噬菌體敏感。說明噬菌體SA-1對沙門菌有較強的裂解能力,同時對大腸桿菌也表現出一定的裂解能力。

3 討論

沙門菌病是由沙門菌引起的人和動物食源性疾病；某些血清型沙門菌例如鼠傷寒沙門菌感染畜禽后呈潛伏狀態,雖無明顯病癥,但會持續排菌,以及污染其下游相關產品，是沙門菌引起食源性疾病的主要原因,不僅極大地提高了食源性致病菌擴散的風險,而且嚴重阻礙了養殖業的發展，危害了人類健康。

噬菌體在自然界分布廣泛,可以說幾乎有細菌存在的地方就有其相應的噬菌體存在。據Brussow H等[9]報道,地球大約有1032個噬菌體存在,其數量相當于細菌數量的十幾倍。根據噬菌體的作用方式可以將其分為溶原性噬菌體和烈性噬菌體兩大類,其中溶原性噬菌體在感染細菌后,其遺傳物質會整合到細菌的遺傳物質上,隨細菌遺傳物質復制而復制,在正常情況下不會大量繁殖,故而達不到裂解宿主菌的效果;而烈性噬菌體在感染宿主細菌后,會在其內部迅速大量繁殖,從而裂解宿主菌。烈性噬菌體雖然會對細菌造成巨大的殺傷,但是對人和動物是安全的,不會產生威脅[10]。

本研究從河南省安陽市某規模化養殖場污水樣品中分離到沙門菌噬菌體SA-1；純化后，其在平板上形成的噬菌斑大而透亮，邊緣清晰，無暈環,直徑在3～5 mm。在本研究中，噬菌體SA-1的初始效價測定為1.15×1010PFU/mL,高于陳義寶等[11]測定的腸炎沙門氏菌噬菌體SP01的效價1.2×109PFU/mL、仇笑笑等[12]測定的沙門菌噬菌體CR5的效價109PFU/mL,說明SA-1屬于高效價噬菌體,對沙門菌具有更高的殺傷力。噬菌體SA-1經DNase I酶、RNase A酶酶切分析后,判定其遺傳物質為DNA。本研究測定發現，噬菌體SA-1的最佳感染復數為0.001,說明SA-1在感染宿主沙門菌時,很小的數量級就能發揮出良好的裂解性能,這也是在實際抗菌應用中噬菌體相對于抗生素的優勢體現。SA-1的生長曲線顯示：其潛伏期為0～10 min，裂解期為10～30 min,在30 min后進入穩定期,裂解量高達108 PFU/cell。與Tang F等[5]和Cai R P等[13]分離的噬菌體相比,噬菌體SA-1的潛伏期短,暴發期更短,能夠更快地殺滅細菌。SA-1的裂解量達108 PFU/cell,高于江艷華等[14]報道的沙門菌裂解性噬菌體的裂解量(51 PFU/cell)、包紅朵等[15]報道的腸炎沙門菌的裂解量(22 PFU/cell)。SA-1對溫度和pH表現出較強的耐受性,在pH為3～11區間內活性穩定，在50 ℃內活性穩定,在60 ℃及更高溫度下其活性會逐漸降低,比趙影等[16]報道的鼠傷寒沙門氏菌噬菌體ΦBLCC8-0050-3(其適宜溫度為30～50 ℃，適宜pH值為5～10)和Imam M等[17]報道的噬菌體MIJ3(其適宜溫度為30～60 ℃，適宜pH值為3～10)的適應范圍廣。噬菌體SA-1能夠裂解沙門氏菌JS標準菌株、多株除宿主沙門菌外的沙門菌臨床分離株，以及幾株大腸桿菌臨床分離株,說明SA-1對沙門菌具有良好的裂解性能。盡管噬菌體自身具有較強的特異性,但在本實驗中涉及的幾株大腸桿菌臨床分離株也對噬菌體SA-1表現出了敏感性,此現象有待于進一步研究。

綜上所述,噬菌體SA-1屬于裂解性噬菌體,不僅對沙門菌有較強的裂解能力,還具有較強的溫度及酸堿耐受性,體現出很高的應用價值,有希望成為一種新型的治療沙門菌病的武器,值得進一步研究。