濱海白首烏黃酮超聲輔助提取工藝優化

孫 倩,馮 進,李春陽*, Chuon Mony Roth, Sun Sovath, Taing Bunhok

(1.南京理工大學 化工學院,江蘇 南京 210094;2.江蘇省農業科學院 農產品加工研究所,江蘇 南京 210014;3.柬埔寨農業漁業部農產品和食品實驗室,金邊 10103)

濱海白首烏又稱白人參,它不僅是濱海有名的傳統特產,還是中國傳統的“藥食同源”食材、中藥材。現代藥理活性研究表明:白首烏具有抗腫瘤、抗衰老、抗缺氧、降血脂、調節免疫功能等生物活性[1-3]。目前,從白首烏中分離得到的化學成分有C21甾苷、磷酯類、黃酮類、多糖、氨基酸以及維生素等[4-5]。黃酮類化合物是由植物在光合作用下產生的一大類化合物,其一般具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂、調節免疫功能等作用[6-8]。超聲波輔助提取技術是一種有效的分離技術,它主要是采用超聲波的空化作用,即當一定頻率的超聲波開始作用于溶液時,液體中大小適宜的小氣泡會發生共振現象,強有烈的沖擊波會使細胞壁破裂,其中的有效物質溶出,并且整個體系不會因溫度大幅升高而破壞掉其中的有效成分,能強化浸提效率,而且高效、節能、省時,因而具有極高的應用價值[9-10]。此方法在天然產物浸提方面得到了越來越多的應用。本實驗通過單因素和正交試驗優化了濱海白首烏黃酮的提取工藝,以期為進一步研究和開發白首烏提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濱海白首烏粉末，由鹽城果老首烏科技有限公司提供;蘆丁對照品，由國藥集團化學試劑有限公司提供;無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁,均為分析純;試驗用水為二次去離子水。

BS210S型電子天平，為北京Sartorious公司的產品; UV1700PC紫外可見分光光度計，為上海奧析科學儀器有限公司產品; KQ-100DB超聲波清洗儀，為昆山舒美超聲儀器有限公司產品; SHZ-D型循環水真空泵，為鞏義市瑞德儀器設備有限公司產品; DHQ-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，由上海精宏實驗設備有限公司生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制[11]準確稱取10.6 mg的蘆丁標準品于燒杯中,用80%的乙醇溶液溶解后定容于50 mL的容量瓶中,搖勻,得到濃度為0.212 mg/mL的蘆丁對照品溶液。分別精密移取對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置于10 mL比色管中,再分別加入80%乙醇溶液至總體積3 mL;再加5%亞硝酸鈉0.4 mL，混勻;放置6 min后加入10%硝酸鋁0.4 mL，混勻;放置6 min后再加入4%氫氧化鈉4 mL,均用蒸餾水定容至10 mL,充分混勻,放置15 min。以第1管作為空白,于510 nm波長處測定其吸光度,以吸光度值對應蘆丁濃度繪制標準曲線。

1.2.2 精密度試驗 準確移取0.212 mg/mL的蘆丁對照品溶液3.0 mL,按1.2.1中的方法平行測定吸光度值5次,計算其吸光度的相對標準偏差(RSD)。

1.2.3 重復性試驗 準確移取5份0.212 mg/mL的蘆丁對照品溶液1.0 mL,依次按1.2.1中的方法測定吸光度值,計算其吸光度的RSD值。

1.2.4 加標回收率試驗 準確移取5份0.12 mg/mL的白首烏黃酮提取液1.0 mL,分別精確加入0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg蘆丁對照品,按1.2.1中的方法測定吸光度值,計算回收率?；厥章?(加標樣品含量-樣品含量)/加標量×100。

1.2.5 白首烏總黃酮的提取工藝 準確稱取白首烏塊根的干燥粉末0.50 g于50 mL具塞錐形瓶中,按要求加入一定量的乙醇溶液,利用超聲波法協同有機溶劑輔助提取工藝,在一定溫度、一定功率下超聲提取一定時間,抽濾,將得到的提取液定容于25 mL的容量瓶中，待測。

1.2.6 單因素試驗設計[12]

1.2.6.1 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響 準確稱取一定質量的白首烏粉末，置于具塞錐形瓶中,按液料比20∶1向其中加入體積分數分別為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇,在超聲時間為25 min、超聲溫度為50 ℃、超聲功率為400 W的條件下提取,抽濾定容得到提取液；移取1 mL提取液，按1.2.1中的方法測定其吸光度,計算總黃酮提取量；做3次平行試驗,探究乙醇濃度對總黃酮提取量的影響。

1.2.6.2 液料比對總黃酮提取量的影響 準確稱取一定質量的白首烏粉末，置于具塞錐形瓶中,按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1分別向其中加入體積分數為80%的乙醇,在超聲時間25 min、超聲溫度50 ℃、超聲功率400 W的條件下提?。黄溆嗖僮魍?.2.6.1中的操作,探究液料比對總黃酮提取量的影響。

1.2.6.3 超聲時間對總黃酮提取量的影響 準確稱取一定質量的白首烏粉末,按液料比30∶1向其中加入體積分數為80%的乙醇,在超聲時間分別為10、20、30、40、50 min,超聲溫度50 ℃,超聲功率400 W的條件下提?。黄溆嗖僮魍?.2.6.1中的操作,探究超聲時間對總黃酮提取量的影響。

1.2.6.4 超聲溫度對總黃酮提取量的影響 準確稱取一定質量的白首烏粉末,按液料比30∶1向其中加入體積分數為80%的乙醇,在超聲時間20 min,超聲溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,超聲功率400 W的條件下提?。黄溆嗖僮魍?.2.6.1中的操作,探究超聲溫度對總黃酮提取量的影響。

1.2.6.5 超聲功率對總黃酮提取量的影響 準確稱取一定質量的白首烏粉末,按液料比30∶1向其中加入體積分數為80%的乙醇,在超聲時間20 min,超聲溫度40 ℃,超聲功率分別為240、280、320、360、400 W的條件下提?。黄溆嗖僮魍?.2.6.1中的操作,探究超聲功率對總黃酮提取量的影響。

1.2.7 正交實驗設計 在單因素實驗結果的基礎上,選取其中的乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)和超聲溫度(D)4個主要因素為考察因素,在4個因素里面分別選擇對白首烏總黃酮提取量影響較大的3個水平,選用L9(34)正交表設計正交實驗,以濱海白首烏中的總黃酮提取量為考察指標,每次實驗重復3次,確定最佳的提取工藝組合。

1.2.8 白首烏中黃酮含量的測定方法 移取1 mL提取液置于10 mL比色管中,按1.2.1中的方法測定其吸光度,由回歸方程可得到總黃酮含量,再根據下式計算出總黃酮提取量。

y=(cV1V3)/(V2W)

上式中：y為總黃酮提取量(mg/g);c為移取液的黃酮濃度(mg/mL);V1為移取液的定容體積(mL);V2為移取液的體積(mL);V3為藥材提取液的定容體積(mL);W為藥材質量(g)。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2016、Origin 8.0、SPSS Statistics 23進行數據處理及分析。所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以吸光度值(A)為縱坐標,以蘆丁溶液濃度(c)為橫坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程A=10.883c-0.0076,R2=0.9989;結果表明,當蘆丁濃度在0.01～0.06 mg/mL范圍內時,其與吸光度呈現良好的線性關系。

2.2 精密度試驗結果

5次測定的吸光度值分別為0.692、0.687、0.691、0.678、0.689，計算得到其相對標準偏差(RSD)為0.81%,表明本試驗結果的精密度良好。

2.3 重復性試驗結果

5次測定的吸光度值分別為0.217、0.225、0.219、0.223、0.220，計算得到其RSD為1.45%,表明本試驗的重復性良好。

2.4 加標回收率試驗結果

試驗結果(表1)表明：平均回收率為99.2%, RSD為1.57%,證明該方法準確性高。

表1 加標回收率試驗結果

2.5 單因素試驗結果

2.5.1 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響 由圖1可知,伴隨乙醇濃度的增加,白首烏總黃酮提取量先逐漸增大;當乙醇濃度為80%時,提取量最高,達到2.37 mg/g；此后繼續增大乙醇濃度,提取量下降。這可能是因為當乙醇濃度較低時,黃酮類化合物還未充分溶解,而當乙醇濃度過高時,溶劑極性降低,脂溶性等雜質溶出,與黃酮類化合物競爭同種溶劑[13-15],導致總黃酮提取量降低。故確定最佳乙醇濃度為80%。

圖1 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

2.5.2 液料比對總黃酮提取量的影響 由圖2可知,隨著液料比升高,總黃酮提取量先升高；在液料比為30∶1時提取量最高,達到3.02 mg/g；但繼續增加液料比時提取量下降。這可能是因為溶劑用量較少時,與物料接觸不充分,黃酮類化合物提取不完全,而當溶劑用量過多時,會導致除黃酮之外的其他雜質溶出[13,16]。故確定最佳液料比為30∶1。

圖2 液料比對總黃酮提取量的影響

2.5.3 超聲時間對總黃酮提取量的影響 從圖3可以看出：當超聲時間在20～50 min內增加時,總黃酮提取量呈降低趨勢；而當超聲時間在10～20 min范圍內增加時,提取量呈增大趨勢。這可能是因為在一定的時間內,超聲波有利于增加白首烏中黃酮類化合物的溶出,但當提取時間較長時,溫度較高,溶劑揮發,部分黃酮可能會被氧化,黃酮類化合物分子結構遭到破壞,使得提取量降低[9,17]。故確定最佳超聲時間為20 min。

圖3 超聲時間對總黃酮提取量的影響

2.5.4 超聲溫度對總黃酮提取量的影響 由圖4可見：當超聲溫度在30～40 ℃范圍內升高時,總黃酮提取量呈增大趨勢；隨著超聲溫度在40～50 ℃范圍內逐漸升高,總黃酮提取量呈下降趨勢；隨著超聲溫度在50～70 ℃范圍內升高,總黃酮提取量變化不大。這可能是因為當超聲溫度低時,超聲波頻率較小,溶質還未充分接觸溶劑,提取量低；當溫度過高時,部分黃酮類物質可能被氧化或分解,并且加速其他雜質的溶出，致使提取量降低[18]。同時可以看出超聲提取法的最佳溫度遠低于水浴提取法的最佳溫度[19]。因此,確定最佳超聲溫度為40 ℃。

圖4 超聲溫度對總黃酮提取量的影響

2.5.5 超聲功率對總黃酮提取量的影響 由圖5可知：在240～280 W的超聲功率范圍內,總黃酮提取量呈增大趨勢；隨著超聲功率在280～400 W范圍內逐漸升高,總黃酮提取量呈現下降趨勢。這可能是因為增大超聲波功率會加強細胞的破碎力度,從而使得黃酮溶出量加大；但是過度增加超聲波功率,不僅會增加能耗,而且因其強烈的空化作用會破壞有效成分,導致提取量降低[20-21]。因此,最佳超聲功率為280 W。

圖5 超聲功率對總黃酮提取量的影響

2.6 正交試驗結果

正交試驗各因素的水平如表2所示,結果如表3所示。

表2 正交試驗各因素的水平

由表3可知,各個因素水平對總黃酮提取量有不同的影響,由極差分析結果可知,4個因素對提取量的影響大小為A>B>C>D,確定的最佳提取工藝條件是A3B1C3D2；在此組合條件下,進行3次驗證試驗,總黃酮平均提取量為3.95 mg/g，高于鄒艷敏[22]用回流法和微波法提取的白首烏黃酮量(3.53 mg/g)。與張鋒等[19]用水浴回流提取法提取的白首烏黃酮量(2.8544 mg/g)相比,本試驗提取的總黃酮量不僅大幅增加,而且使用超聲波輔助法提取白首烏黃酮操作方便,提取時間(3 h)也大大減少。

表3 正交試驗方案和結果

由表4可知：在采用超聲輔助法提取白首烏總黃酮的工藝中,A因素(F0.1

表4 正交試驗方差分析結果

3 小結與討論

本實驗以濱海白首烏為研究對象,以總黃酮為目標化合物,對超聲波輔助提取濱海白首烏總黃酮的工藝進行了系統地探究,得到的最佳提取工藝為:乙醇濃度90%、超聲時間30 min、液料比20∶1,超聲溫度40 ℃。在此最佳條件下,白首烏中總黃酮提取量為3.95 mg/g。對超聲波輔助法提取有影響的因素較多,鑒于此,我們對白首烏總黃酮提取的其他影響因素還需進一步探究。本研究結果為進一步探討白首烏黃酮等成分的提取提供了參考依據。