基于絡合反應納米自聚集的熒光/表面增強拉曼光譜雙傳感模式檢測鋅離子

鄭思傾　李丹　鄧維　司文帥　白冰

摘 要 納米光學探針具有獨特的結構特征和光學特性， 受到廣泛的關注。本研究合成了一種新的熒光/表面增強拉曼散射（SERS）雙模式納米光學探針， 利用羥基苯甲酸衍生物（NAMH）的酚羥基和席夫堿對Zn2+具有優良親和力的特性， 構建了NAMH修飾銀納米顆粒（AgNPs@NAMH）探針， AgNPs@NAMH與Zn2+之間發生特異的絡合作用， 誘導熒光信號猝滅， 可用于復雜樣本中Zn2+的熒光檢測， 檢出限為0.32 nmol/L。此外， 絡合反應引發AgNPs發生自聚集， 可實現對Zn2+的超靈敏SERS檢測， 檢出限為0.68 pmol/L。本方法具有操作簡單、快速、高靈敏和高選擇性等優點， 為環境污染物的即時檢測提供了技術支持。

關鍵詞 熒光; 表面增強拉曼光譜; 絡合反應; 鋅離子

1 引 言

微量鋅離子（Zn2+）參與機體內多種酶合成[1]， 適量的Zn2+對控制血糖有積極作用[2]， Zn2+缺乏或過量可能引起特定的免疫反應[3]。因此， 開發高靈敏和高特異性的Zn2+快速檢測方法意義重大。傳統的Zn2+快速檢測方法包括比色法和電化學分析法等， 這些方法具有操作簡便、測定快速和分析范圍廣等優勢， 但是這些方法大多選擇性低， 且對環境有污染 [4]。

熒光分析法具有靈敏度高、測定快速和可視化等特點， 被廣泛用于Zn2+的現場快速檢測[5]， 但易受到復雜基體的干擾。表面增強拉曼光譜（SERS）具有“指紋”特性， 水的干擾小， 因而在污染物現場檢測領域備受關注[6， 7]， 但是， 金屬離子的拉曼截面積小， 表面親和力弱， 限制了SERS在環境檢測中的應用[8， 9]。結合熒光和SERS方法的特點， 開發兼具熒光和SERS性能的納米光學探針有助于實現Zn2+的快速、準確檢測。目前， 文獻報道的多模式分析方法多是通過比色法和熒光法實現Zn2+的檢測， 但通常具有檢測濃度范圍窄和背景干擾大等不足[10]。Velmurugan等[11]設計的喹啉苯并咪唑共軛物對Zn2+顯示出高選擇性， 但檢出限僅為1.5×10-5 mol/L。Ghorai等[12]制備了一種用于Zn2+檢測的化學探針， 實現了對Zn2+的靈敏檢測， 但是不能有效區分Cu2+和Zn2+。因此， 開發一種高靈敏、高特異性的Zn2+多模式納米光學探針具有重要的應用價值。

本研究合成了4， 4′-（（（1E， 1′E）-（萘-2， 6-二基雙（氮雜亞烯基））雙（甲烷亞基））雙（3-羥基苯甲酸）（NAMH）修飾銀納米粒子（AgNPs）的納米探針， 基于納米探針與Zn2+之間的絡合反應， 可利用熒光和SERS雙傳感模式實現Zn2+的分析檢測。本方法與現有分析方法[13， 14]比較， 一方面可根據熒光和SERS信號的變化， 實現亞pmol/L級的Zn2+快速檢測; 另一方面， 兩種檢測手段可以單獨或合并使用， 從而為現場檢測提供精準可靠的分析結果， 因而有效降低了假陽性和假陰性結果的產生。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV-2600紫外-可見分光光度計（日本島津公司）; F97熒光分光光度計（上海棱光技術有限公司）; BWS415-785S便攜式拉曼光譜儀（美國必達泰克公司）; Master-S15超純水機（上海泰坦科技股份有限公司）; 1500D單反照相機（日本尼康公司）。

AgNO3、檸檬酸鈉、2， 6-二氨基萘、4-甲酰基-3-羥基苯甲酸、L-半胱氨酸、KH2PO4、ZnCl2（分析純， 阿拉丁試劑（上海）有限公司）; 其它試劑均為分析純; 實驗用水為超純水（18 MΩ·cm）。

2.2 實驗方法

2.2.1 羥基苯甲酸衍生物（NAMH）的合成 利用改進的文獻[15]的方法制備NAMH。首先， 將2， 6-二氨基萘（1.58 mg， 10 μmol）和4-甲酰基-3-羥基苯甲酸（3.32 mg， 20 μmol）溶于40 mL無水乙醇中， 60℃攪拌反應12 h。用二氯甲烷對產物進行萃取， 將有機層用無水Na2SO4干燥， 旋轉蒸發， 得到粗產物， 通過硅膠柱色譜法純化， 以二氯甲烷-乙醇（95∶5， V/V）作為洗脫劑， 所得粗產物為橙黃色固體。1H NMR （501 MHz， DMSO） δ 12.24 （s， 2H）， 9.15 （s， 2H）， 8.26 （d， J=9.0 Hz， 2H）， 8.10 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 8.01 （d， J=9.0 Hz， 2H）， 7.58 （d， J=8.1 Hz， 2H）， 7.51 （t， J=7.6 Hz， 2H）， 7.05 （d， J=8.4 Hz， 2H）（1H NMR圖見電子版文后支持信息圖S1）。

2.2.2 NAMH修飾銀納米粒子（AgNPs@NAMH）的制備 通過配體交換法合成AgNPs@NAMH。首先， 將1 mL AgNPs（合成方法見電子版文后支持信息）分散在5 mL水中， 滴加1 μmol/L L-半胱氨酸（0.1 mmol）并劇烈攪拌反應12 h， 以8000 r/min離心5 min， 除去過量的L-半胱氨酸。然后， 將純化的AgNPs@L-Cys重新分散在1 mL水中。將1 mL AgNPs@L-Cys和1 mL NAMH（0.5 mmol）混合， 在室溫下反應24 h， 8000 r/min離心10 min， 以除去過量的NAMH， 沉淀物重新分散在5 mL乙醇中， 在4℃下保存。根據朗伯比爾定律[16]， 通過AgNPs的粒子濃度估算AgNPs@NAMH的濃度。

2.2.3 熒光光譜法和SERS檢測Zn2+ AgNPs@NAMH以磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L， pH 7.0）稀釋至10 μmol/L， 加入10 μL不同濃度的ZnCl2溶液。所得混合物在25℃下反應10 min， 然后采用熒光和SERS法測定。當進行熒光檢測時， 用熒光分光光度計記錄混合物的熒光光譜變化（激發波長380 nm， 狹縫寬度5 nm）， 單反相機記錄在365 nm激發下的熒光圖像。SERS測量在便攜式拉曼光譜儀上進行， 測試條件：785 nm激光（10 mW）， 積分時間30 s， 放大倍數/數值孔徑為10 ×/0.25的顯微物鏡聚焦。

2.2.4 實際樣品檢測 自來水、湖水、海水和土壤取自學校及周邊， 自來水、湖水、海水通過0.22 μm的濾膜除去不溶物， 土壤樣本（5 g）首先用50 mL丙酮洗滌兩次， 然后用水沖洗， 并在30℃下干燥。稱取1.0 g土壤， 用100 mL HNO3（63%， m/V）和50 mL H2O2（30%， m/V）溶解， 在（150±5）℃下反應2 h， 然后趕酸至近干， 用0.22 μm聚四氟乙烯濾膜除去不溶物， 取濾液5 mL， 用水定容至50 mL， 作為樣品溶液。采用熒光和SERS光譜法分析樣品溶液。

3 結果與討論

3.1 AgNPs@NAMH的合成與表征

AgNPs@NAMH納米探針合成過程如圖1所示， 4-甲酰基-3-羥基苯甲酸（FAH）的醛基與2， 6-二氨基萘（DAN）的氨基共價鍵合得到產物（NAMH）， 具有強的金屬離子絡合能力和較大的拉曼截面， 可用作Zn2+的探針分子。

AgNPs@NAMH的吸收光譜如電子版文后支持信息圖S2所示， 在280和356 nm具有明顯的紫外吸收峰， 分別歸屬于CN鍵和萘環的吸收峰[17]， 402 nm處的吸收峰來源于AgNPs的局域表面等離子體吸收[18]。與兩種原料FAH和DAN的熒光光譜比較， 產物NAMH在537 nm 處產生了一個新峰（圖2A）， 該峰可以歸屬于雙萘基系[19]。此外， AgNPs@NAMH的拉曼光譜出現了CN（1616 cm-1）和羰基（1922 cm-1）振動的特征峰（圖2B曲線c）[20]。以上結果表明， 已成功制備AgNPs@NAMH。

3.2 AgNPs@NAMH對Zn2+的熒光和SERS的響應機理

考察了AgNPs@NAMH對Zn2+的熒光和SERS響應。由圖3A所見， AgNPs@NAMH 與Zn2+反應后， 探針在537 nm的熒光強度（F537 nm）明顯降低， 同時伴隨探針在1616 cm-1處拉曼信號的降低和1922 cm-1處拉曼信號的升高（圖3B）。 結果表明， 此納米探針對Zn2+有良好的熒光和SERS響應。為了研究Zn2+對AgNPs@NAMH 的刺激響應機理， 考察了共存金屬離子對反應體系的熒光和SERS響應。如圖3C和3D所示， 當單獨加入干擾離子， F537 nm、1922與1616 cm-1拉曼峰強度比值（I1922/I1616）并未出現明顯的變化; 當同時加入干擾物與Zn2+時， F537 nm明顯降低， 并且I1922/I1616增加， 表明AgNPs@NAMH對Zn2+具有高特異性。

Zn2+和NAMH的Job分析如圖4A所示， 最大摩爾分數為0.5， 表明Zn2+和NAMH之間的化學計量比為1∶1。熒光滴定結果（圖4B）表明， NAMH-Zn2+的締合常數（Ka）為1.48×107 L/mol[21]， 表明此納米探針與Zn2+具有較強的結合能力。Zn2+作為一種順磁性離子， 可通過與熒光團形成絡合物發生電子或能量轉移， 進而強烈抑制納米探針的熒光發射[22， 23]。此外， Zn2+與CN和酚羥基之間具有較高的親和力和較快的結合動力學過程， 從而可實現Zn2+與其它金屬離子的區分檢測[24]。另外， NAMH與Zn2+的絡合作用會誘導AgNPs@NAMH發生納米顆粒自聚集， 并產生大量的“熱點”[25]， 從而使體系的拉曼光譜信號得到極大增強。以上結果表明， AgNPs@NAMH對Zn2+具有較高的熒光和SERS選擇性， 有望用于復雜樣品中Zn2+的現場快速篩查。

3.3 基于AgNPs@NAMH的Zn2+熒光和SERS雙傳感檢測

由于Zn2+加入前后， 反應體系的F537 nm和I1922/I1616對于Zn2+具有明顯響應（圖3A和3B）， 本研究考察了不同實驗條件對反應體系F537 nm和I1922/I1616的影響。當AgNPs@NAMH濃度為10 μmol/L、 AgNPs與NAMH的摩爾比為1∶5000時（電子版文后支持信息圖S3和S4）， F537 nm和I1922/I1616達到最大值， 并保持穩定， 這可能是由于NAMH在AgNPs表面吸附達到飽和。此外， AgNPs@NAMH與Zn2+之間的絡合作用在10 min內反應基本完成（電子版文后支持信息圖S5）， 因此， 選擇10 min作為Zn2+檢測時間。反應體系pH=7.0時， 可獲得最佳的熒光和SERS響應（電子版文后支持信息圖S6）， 這可能是由于弱酸性條件（pH≤6.0）下， NAMH的氮原子發生質子化， 阻礙了AgNPs@NAMH-Zn2+復合物的形成， 而弱堿性（pH 8.0～10.0）容易誘導Zn2+形成沉淀。AgNPs@NAMH在20～25℃內檢測性能相對穩定（電子版文后支持信息圖S7）， 因此， 選擇在25℃下進行檢測。在最佳條件下， 測定了不同濃度的Zn2+存在下探針的熒光光譜。隨著Zn2+濃度逐漸增大， AgNPs@NAMH的F537 nm隨之降低（圖5A）， F537 nm與Zn2+濃度的對數呈線性關系（圖5B）， 線性方程為F537nm=-576.05×lg[Zn2+]+203.63， 相關系數 R2=0.99， 檢出限為0.32 nmol/L（S/N=3）。

為探究AgNPs@NAMH對Zn2+的SERS檢測性能， 測試了不同濃度Zn2+存在下AgNPs@NAMH的SERS光譜。由圖5C可見， 隨著Zn2+濃度增加， 1922 cm-1的拉曼峰強度隨之增加， 1616 cm-1的拉曼峰強度逐漸降低， 這可能是由于納米顆粒聚集產生大量“熱點”， 使得1922 cm-1的SERS信號增加， 即使Zn2+濃度降至10-6 μmol/L， 該SERS信號也可以被識別， 1616 cm-1處拉曼峰降低可能是NAMH表面取向變化和分子極化率張量變化所致[26， 27]。因此， I1922/I1616可作為定量評估AgNPs@NAMH對Zn2+的SERS檢測的特征值。I1922/I1616與Zn2+濃度對數之間具有良好的線性關系（圖 5D）， 線性校正曲線方程為I1922/I1616=0.42 lg[Zn2+]+2.09， 檢出限為0.68 pmol/L（S/N=3）。

為了進一步評估AgNPs@NAMH檢測Zn2+的重復性， 采集同一探針上10個不同位置的拉曼光譜， 測定結果的相對標準偏差（RSD）為11.7%（電子版文后支持信息圖S8）， 表明納米探針AgNPs@NAMH具有良好的重復性。同時， AgNPs@NAMH還顯示出良好的穩定性（電子版文后支持信息圖S9）。以上結果表明， AgNPs@NAMH可作為穩定、可靠的熒光和SERS雙模納米探針用于Zn2+的分析檢測。與文獻報道方法相比， 本方法具有寬的檢測范圍、低的檢出限和較短的檢測時間（電子版文后支持信息表S1）， 可以滿足復雜樣本現場快速檢測的需求。

3.4 實際樣品中Zn2+的熒光和SERS雙重檢測

為驗證AgNPs@NAMH用于現場檢測Zn2+的可行性， 考察了熒光和SERS雙模式方法分析復雜環境樣品中Zn2+的檢測性能， 結果見表1。 熒光和SERS方法的回收率為82.8%～116.2%， RSD小于15%; 此外， 熒光和SERS方法的分析結果與電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法的結果一致。

4 結 論

建立了一種基于AgNPs@NAMH的Zn2+檢測方法， 通過Zn2+誘導AgNPs@NAMH自聚集， 實現Zn2+的熒光和SERS雙傳感檢測。此方法結合了熒光法和SERS方法的優勢， 可通過裸眼直接觀察， 實現Zn2+的快速定性和半定量分析; 另一方面， 通過測量熒光和SERS雙模式的信號進行Zn2+含量的準確分析， 可用于復雜樣本中Zn2+的現場快速篩查和精準分析， 有望在環境分析領域得到廣泛應用。

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Fluorescence and Surface Enhanced Raman Scattering Dual

Modal Detection of Zn2+ Based on Complexation

Reaction-Induced Self-Aggregation of Nanoparticles

ZHENG Si-Qing1， LI Dan*1， DENG Wei1， SI Wen-Shuai2， BAI Bing2

1（School of Chemical and Environmental Engineering， Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China）

2（Institute for Agro-Food Standards and Testing Technology， Shanghai Academy

of Agricultural Sciences， Shanghai 201403， China）

Abstract Optical nanoprobes have attracted extensive attention in area of analytical chemistry because of their unique structural characteristics and optical properties. In this study， a novel fluorescence/surface-enhanced Raman scattering （SERS） dual-modal nanoprobe was developed. The phenolic hydroxyl group and Schiff base of hydroxybenzoic acid derivative （NAMH） exhibited a preferential affinity towards Zn2+. The complexation between AgNPs@NAMH and Zn2+ induced the quenching of the fluorescent signal of NAMH， thus enabling the fluorescent detection of Zn2+ in complex samples with a detection limit of 0.32 nmol/L. Moreover， the Zn2+-triggered AgNPs aggregation led to the formation of abundant “hot spots” among NPs， which could be used for SERS analysis of Zn2+ with a detection limit of 0.68 pmol/L. This method had a number of advantages over conventional approaches in simplicity of operation， rapidity， high sensitivity and high selectivity， and provided new technical support for the immediate detection of environmental pollutants.

Keywords Fluorescence; Surface-enhanced Raman scattering; Complexation reaction; Zinc ion

（Received 25 May 2020; accepted 13 August 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21507089， 21976123） and the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality （No. 19391901800）.

2020-05-25收稿; 2020-08-13接受

本文系國家自然科學基金項目（Nos. 21507089， 21976123）和上海市科學技術委員會農業領域項目（No.19391901800）資助

* E-mail： dany@sit.edu.cn