十元瓜環主客體比率型熒光探針對尼羅替尼的識別和檢測

李孟軒　殷婷　肖尊宏　倪新龍

摘 要 利用紫外-可見吸收光譜與熒光光譜研究了了十元瓜環（Q[10]）與芘衍生物的主客體作用， 并通過量化理論計算了其超分子組裝結構。計算結果表明， 客體中的芘分子以頭碰頭的形式從Q[10]的兩端反方向平行進入其疏水大空腔， 形成2∶1的絡合物。等溫滴定量熱實驗結果表明， 系列主客體絡合反應是焓變驅動。同時， 利用芘熒光基團的特征單體/二聚體熒光發射構建了基于Q[10]主客體組裝的比率型熒光探針， 研究結果表明， 此主客體體系在水溶液中對藥物分子尼羅替尼具有較好的選擇與識別性能， 并在一定濃度范圍內具有良好的線性關系， 檢出限為7.05 μmol/L。

關鍵詞 十元瓜環; 芘類衍生物; 主客體作用; 尼羅替尼; 熒光探針

1 引 言

尼洛替尼（NL）是強效精準的第二代酪氨酸激酶抑制劑[1]， 對慢性髓性白血病（CML）患者具有較好的治療作用。NL在CML患者體內主要通過化學反應代謝為分解產物， 在健康人體內則主要以原藥的形式存在[2，3]。理論上， 通過監測CML患者體內NL含量能夠對其恢復情況進行有效評估[4，5]。NL的檢測方法包括液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）和高效液相色譜法（HPLC）等方法[6，7]。2016年， Yilmaz等[8]利用反相高效薄層色譜法（RP-HPLC）-熒光檢測法測定了血漿、尿液和膠囊中NL的含量。以上儀器方法雖然可以對NL定量檢測， 但由于所用儀器比較昂貴、檢測成本高， 不利于推廣。因此， 開發能夠快速、簡單、低成本測定NL的方法十分重要。

基于主客體作用的瓜環熒光探針[9，10]是以瓜環作為受體分子與熒光染料客體通過非共價鍵作用形成的探針體系， 目標物通過競爭作用取代染料客體分子進入瓜環空腔， 進而改變染料客體分子的熒光發射， 實現目標物質的識別檢測。因此， 基于瓜環主客體競爭方法構建的熒光探針具有靈敏度高、選擇性好、快速、無損等優點。

十元瓜環（Q[10]）[11]主要以Q[5]@Q[10]包合物的形式存在， 非常難分離。最近， 研究者發展了一種能夠將Q[10]從Q[5]@Q[10]混合物中快速分離的方法[9]。到目前為止， Q[10]是系列瓜環化合物中具有最大空腔的分子[10]， 能包合五元瓜環[11]、金屬卟啉[12]、三聯吡啶[13]等大尺寸分子[14]。Zhang等[15]利用Q[10]主客體熒光探針實現了Fe3+和Ag+的識別和檢測。然而， Q[10]主客體超分子體系作為熒光探針用于分析檢測的報道很少。

目前， 大多數熒光探針主要通過單一的熒光“關閉”-響應或“開啟”-響應的方式進行檢測[9]， 由于是單一發射峰的變化， 易受儀器效率、光散射以及微環境的影響。相較而言， 比率型熒光探針由于是采用兩個不同波長熒光強度的比值進行識別檢測， 因此具有靈敏且不易受外界因素干擾的優點[16，17]。芘及其衍生物具有獨特的單體熒光發射峰（37 9和393 nm）和二聚體熒光發射峰（480 nm）[18]的光學性質， 被廣泛用于熒光傳感及分子標記。但是， 目前尚未有利用熒光光譜法直接檢測NL的文獻報道。本研究以芘染料客體分子與Q[10]形成的超分子體系為比率型熒光探針（圖1）， 實現了水溶液中藥物分子NL的熒光檢測。檢測機理是因為兩個芘染料基團能夠同時被Q[10]空腔容納， 形成芘的特征二聚體熒光（480 nm）， NL通過競爭作用取代芘客體分子進入Q[10]空腔， 使客體變成游離分子從而產生單體芘分子熒光（379 nm）， 實現比率熒光法檢測NL。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

pHS-3C型pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）; CaryEclipse熒光光度計（美國瓦里安公司）; Agilent 8453型紫外-可見分光光度計（美國安捷倫公司）; 等溫滴定量熱儀（美國TA公司）。金剛烷胺（98%）、芘甲醛（98%）、芘甲胺鹽酸鹽（G1， 95%） 購自上海阿拉丁試劑公司; NL購自南京奇可醫藥化工有限公司; 磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海泰坦公司。實驗用水為超純水。

2.2 主體Q[10]的合成

Q[10]是普通瓜環合成中形成的大空腔瓜環（同時生成Q[5]、 Q[6]、 Q[7]、 Q[8]、 Q[10]）， 產率較低，且主要以Q[5]@Q[10]包合物的形式存在[11]。由于Q[5]@Q[10]包合物的結合常數比較大， 所以純Q[10]分離非常困難。本研究通過加入大量金剛烷胺取代Q[5]@Q[10]包合物中的Q[5]分子， 在水中形成金剛烷胺@Q[10]沉淀， 用DMSO加熱回流反復提取Q[10]空腔中的金剛烷胺， 得到高純度的Q[10]。純Q[10]的 1H NMR譜圖見電子版文后支持信息圖S1。 1H NMR（400 MHz， 8 mol/L DCl） δ： 3.41 （d， J = 8.4 Hz， 20H）， 3.28 （s， 20H）， 1.96 （d， J = 8.8 Hz， 20H）。

2.3 客體G2的合成

稱取200 mg 1-金剛烷胺鹽酸鹽和1.6 g NaOH加入到圓底燒瓶中， 加入25 mL無水甲醇， 攪拌成均勻的混懸液， 反應1 h， 抽濾， 濾液轉移至100 mL圓底燒瓶中。稱取230 mg芘甲醛， 加入20 mL無水甲醇溶解， 將所得溶液滴加到燒瓶中， 在61℃下回流12 h， 冷卻至室溫， 加入500 mg NaBH4， 60℃回流12 h， 冷卻至室溫， 減壓蒸餾， 得到淡黃色固體。固體用20 mL二氯甲烷溶解， 加入20 mL水萃取， 有機相減壓蒸餾， 抽濾、 干燥， 得到250 mg淡黃色固體。將此化合物溶于丙酮， 再滴加HCl制成鹽酸鹽， 最后得到客體G2[19]。1H NMR（400 MHz， D2O） δ： 8.31 （dd. J=13.8， 7.6 Hz， 2H）， 818 （d， J=8.7 Hz， 1H）， 8.13～8.02 （m， 4H）， 7.69 （dd， J=13.6， 8.7 Hz， 2H）， 4.10 （S， 2H）， 220 （S， 3H）， 1.90 （S， 6H）， 1.75 （d， J=12.0 Hz， 3H）， 1.66 （d， J=12.2 Hz， 3H）。

2.4 吸收光譜與熒光光譜分析

用PBS緩沖液（pH 2.0）配制1.0×10-5 mol/L Q[10]作為母液， G1和 G2分別配成1.0×10-4 mol/L溶液（pH 2.0）， 用pH=2.0的HCl溶液配制NL母液（1.0× 10-3 mol/L）。在Q[10]/G2溶液中（CQ[10]=5.0×10-6 mol/L， CG2=1.0×10-5 mol/L）滴加NL， 在室溫下， 于200～500 nm范圍內測定其紫外-可見吸收光譜。同樣， 在室溫下測定其熒光發射光譜， 激發和發射狹縫寬為5 nm， 激發波長為345 nm， 電壓為550 V。

2.5 NL存在下主客體體系的光譜性質

將同濃度（1.0× 10-3 mol/L）不同體積（0.0、 3.0、 6.0、 9.0、 12.0、 15.0、 18.0、 21.0、 24.0、 27.0、 30.0、 31.5、 33.0和34.5 μL）的NL溶液（PBS緩沖液， pH 2.0）分別與3.0 mL探針Q[10]/G2主客體組裝體的溶液（CQ[10]=5.0×10-6 mol/L， CG2=1.0×10-5 mol/L）混合 （pH 2.0）， 反應10 min后， 測定熒光發射光譜和紫外-可見吸收光譜。以NL濃度（C）為橫坐標， 熒光發射強度信號比率（I379 nm/I480 nm）變化量ΔF為縱坐標， 繪制校正曲線， 計算NL的檢出限（LOD=3σ/k）。

2.6 熱力學參數分析

將1.0 ×10-4 mol/L客體溶液置于250 μL進樣針內， 在樣品池中加1.0×10-5 mol/L Q[10]溶液， 每次滴加12 μL， 時間間隔250 s。采用相同的實驗條件， 在25℃下分別測定Q[10]/G1、 Q[10]/G2和Q[10]/NL主客體絡合物的熱力學參數。

3 結果與討論

3.1 Q[10]與G1、 G2主客體相互作用的光學性質

在345 nm波長激發下， Q[10]無熒光發射。如圖2所示， 質子化的客體分子G1和G2在pH 2.0水溶液中呈現出芘的典型單體熒光發射峰（379和393 nm）， 隨著Q[10]主體分子的加入， 此發射峰的強度明顯降低， 而在480 nm處芘特征二聚體發射峰的強度逐漸增強， 表明Q[10]與客體發生了絡合作用， Q[10]的剛性疏水性大空腔促使客體分子二聚體和該特征發射峰的形成。通過摩爾比法確定了染料客體與Q[10]的作用比， 結果見電子版文后支持信息圖S2。當主客體摩爾比約1∶2時， Q[10]/G1與Q[10]/G2在480 nm處的熒光發射強度變化趨于平緩， 表明兩個體系都采用摩爾比1∶2 的作用模式。Q[10]/G1與Q[10]/G2主客體作用的紫外-可見吸收光譜（電子版文后支持信息圖S3）顯示， 隨著Q[10]主體分子濃度增加， 客體分子中芘的特征吸收波長的強度明顯降低， 同時在354 nm處出現吸收峰， 且隨Q[10]主體分子逐漸加入， 此吸收峰明顯紅移。 上述結果揭示了主客體絡合作用， 尤其是Q[10]主體分子的剛性籠體結構使其空腔包結的客體分子間的π-π作用增強， 為芘特征二聚體熒光的形成提供了有力證據。

3.2 Q[10]與G1和G2的主客體作用模式

1H NMR（核磁共振）滴定是考察主客體作用模式的有效方法。但是， 由于Q[10]以及與客體分子作用后溶解度較低， 限制了核磁滴定實驗的進行。因此， 本研究運用密度泛函理論 （DFT）方法（Gaussian 16）[20]， 在B3LYP[21]水平上使用def-svp2基組[22]， 對Q[10]與G1、 G2的主客體作用模式進行了計算。如圖3所示， 在能量最小化結構中， G1和G2中的芘基團以頭碰頭的方式從Q[10]的兩端反方向平行進入其疏水空腔， 形成2∶1的絡合物。兩個芘熒光基團間的最短距離為0.45 nm， 說明兩個芘分子之間可以有效形成π-π作用。計算結果進一步揭示， 在Q[10]/G1中， Q[10]羰基氧與客體分子中的氨基陽離子之間存在氫鍵作用（鍵長分別為0.177和0.171 nm）; 同時， G1中的氨基氮正離子與Q[10]端口上的羰基氧之間還存在離子-偶極作用， 鍵長分別為0.277和0.275 nm。計算結果表明， 在Q[10]/G2體系中， G2分子與Q[10]端口羰基氧形成的氫鍵鍵長分別為0.188和0.187 nm， 離子-偶極作用的鍵長則分別為0.289和0.288 nm。根據計算結果， 可以判斷Q[10]/G2絡合物的穩定性小于Q[10]/G1。

3.3 熱力學參數分析

等溫滴定量熱（ITC）法是超分子主客體化學中熱力學研究的常用手段， 該方法主要通過主客體相互作用焓對相關體系的熱力學驅動力進行確定。如表1及電子版文后支持信息圖S4所示， 在室溫（25℃）條件下， 本研究分別對主客體作用體系Q[10]/G1和Q[10]/G2進行ITC滴定， 獲得了相關主客體作用的焓變（ΔH）、 絡合常數（Ka）、 熵變（TΔS）等熱力學數據， 滴定結果表明， Q[10]與G1和G2的摩爾比n均接近2， 由此可知， G1、? G2與Q[10]形成了摩爾比為 2∶1的主客體作用模式， 與熒光發射光譜以及紫外-可見吸收光譜的實驗結果一致。在此基礎上， 主客體體系的結合平衡常數分別為Ka=（1.45 ± 0.63）×105 L/mol（Q[10]/G1）和（2.24 ± 0.25）× 104 L/mol（Q[10]/G2）， 即Q[10]/G1形成了比Q[10]/G2更穩定的主客體作用， 此數據也與量化計算結果一致。同時， ΔH <0、 TΔS <0， 表明G1、 G2與Q[10]的相互作用主要由主客體間的靜電引力即焓驅動[23，24]。

3.4 主客體熒光探針的檢測性能

進一步研究了Q[10]/G1、 Q[10]/G2作為主客體熒光探針對NL分子的識別性能。如圖4A所示， 在pH 2.0 的Q[10]/G2溶液中， 緩慢增加NL分子的濃度， 溶液中的芘二聚體在480 nm發射峰峰強度逐漸減弱， 而芘單體發射峰（379和393 nm）強度則不斷增大， 其溶液熒光顏色從綠色轉變為天藍色 （圖4A 插圖）。這種變化是由于質子化的NL與G2客體產生了競爭作用， 即G2分子被NL擠出Q[10]空腔， 使Q[10]/G2轉變為Q[10]/NL主客體絡合模式。被擠出的G2分子則以單體分子的方式存在于溶液中， 從而在熒光發射光譜中呈現單體熒光。為進一步探討Q[10]與NL的作用機制， 通過1H NMR滴定實驗研究了NL與Q[10]相互作用情況。如電子版文后支持信息圖S5所示， 與Q[10]作用后的NL部分質子峰向高場移動， 說明NL與Q[10]發生了主客體相互作用并進入了Q[10]空腔內（Q[10]空腔的屏蔽作用使質子向高場移動）[12，13]。

ITC數據表明， NL/Q[10]超分子體系在水溶液中的主客體作用比為2∶1（pH 2.0）， 熱力學參數顯示， Q[10]/NL的組裝主要由主客體之間靜電力引起的焓驅動， 說明NL主要以質子化的形式進入Q[10]空腔。Q[10]/NL的絡合平衡常數Ka = （1.26 ± 0.32）×105 L/mol， 與Q[10]/G1的Ka相近， 遠高于Q[10]/G2體系， 說明在酸性溶液中， 質子化的NL與Q[10]的絡合能力大于客體分子G2與Q[10]的結合能力。 因此， 質子化的NL能夠通過競爭作用取代G2進入Q[10]空腔， 進而使Q[10]/G2作為探針產生比率型熒光信號（480 nm處的二聚體熒光發射強度降低， 伴隨著379 nm處的熒光發射強度上升）， 在1×10-6～5×10-4 mol/L范圍內線性關系良好（圖5）， 根據熒光滴定的比率信號， NL的檢出限（3σ）為 7.1 μmol/L （300 ng/mL）， 雖然高于已報道的LC-MS/MS的檢出限（20 ng/mL）[4]， 但是本方法簡單、 快速且成本低。

3.5 Q[10]/G2熒光探針的抗干擾性能

在含有生物體液中常見離子（Cl-、 Ca2+、 K+、 Fe3+、 Na+、 Zn2+、 H2PO-4、 SO2-4、 NH+4）的Q[10]/G2溶液中（pH 2.0），分別加入NL及其類似物吉非替尼、 拉帕替尼及常見藥物賦形劑 （果糖、 葡萄糖、 乳糖、 糊精、 淀粉）， 測定了體系的熒光光譜。如圖4B所示，? Q[10]/G2僅對NL具有明顯的熒光信號響應， 當上述干擾物質同時存在于NL溶液中時， Q[10]/G2探針溶液的熒光發射強度與波長幾乎未發生變化（相對偏差均<5%， 電子版文后支持信息圖S6）， 表明Q[10]/G2作為熒光探針對NL具有良好的選擇識別性能。

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Cucurbit[10]uril Host-Guest Based Ratiometric

Fluorescent Probe for Recognition of Nilotinib

LI Meng-Xuan1， YIN Ting1， XIAO Zun-Hong*2， NI Xin-Long*1

1（Key Laboratory of Macrocyclic and Supramolecular Chemistry of Guizhou Province，

Guizhou University， Guiyang 550025， China）

2（School of Chemistry and Materials， Guizhou Normal University， Guiyang 550025， China）

Abstract Host-guest interaction of cucurbit[10]uril （Q[10] or CB[10]） with pyrene-derived derivatives was evaluated by fluorescence emission spectra and UV-vis absorption spectra， and the host-guest binding modes were studied by density functional theory （DFT）. In the energy minimization structures， the pyrene group of the guest was encapsulated in the larger hydrophobic cavity of Q[10] in parallel from the opposite direction in the form of a head-to-head fashion， forming a 2∶1 inclusion. The thermodynamic data indicated that the two host-guest interactions were enthalpy-driven. Furthermore， the Q[10] host-guest interaction of Q[10]/G2 could be used as ratiometric fluorescent probe based on the unique monomer/excimer emission of pyrene moiety on the guest G2. Experiment results indicated that the host-guest interaction derived probe had good recognition and selectivity for nilotinib in aqueous solution， and the detection limit was 7.05 μmol/L.

Keywords Cucurbit[10]uril; Pyrene-based derivatives; Host-guest interaction; Nilotinib; Fluorescent probe

（Received 18 February 2020; accepted 28 September 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21871063） and the Guizhou University （Nos.20175788， 20185781）.

2020-02-18收稿; 2020-09-28接受

本文系國家自然科學基金項目（No. 21871063）、 貴州省科學技術基金項目（No. 20165656）和貴州大學自然科學基金項目（Nos. 20175788， 20185781）資助

* E-mail： xzh729@126.com; longni333@163.com