漢族人群ADIPOR1 rs7539542與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和2型糖尿病的關聯分析

李 響 蒲連美 阮 楊 李 紅 金澤寧*

(1.首都醫科大學附屬北京安貞醫院急診危重癥中心，北京 100029；2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院心內科，北京 100070)

脂聯素(adiponectin，APN)是一種主要由脂肪細胞分泌的脂肪因子，具有抗感染、胰島素增敏、抗動脈粥樣硬化及抗凋亡等特性，在調節能量代謝方面發揮重要作用[1]。脂聯素受體1(adiponectin receptor 1,ADIPOR1)是介導APN 生物學效應的主要受體之一[2]。ADIPOR1基因過表達可增強APN的生物學效應[3]，而敲除ADIPOR1基因或下調其表達活性，可增加胰島素抵抗和糖異生[4]、增加泡沫細胞的形成，進而加速心血管疾病的進展[5]。基于共同土壤假說[6]，既往研究[7-8]顯示ADIPOR1基因多態性與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery disease，CAD)和2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)等代謝性疾病的易感性相關。然而，具有如此多效性關聯的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點均位于ADIPOR1基因的內含子區，目前鮮有陽性SNPs在ADIPOR1基因非內含子區的報道。因此，本研究旨在測序ADIPOR1基因外顯子、5′和3′非翻譯區(untranslated regions,UTR)區域，分析ADIPOR1基因非內含子區的SNPs是否與CAD和/或T2D的易感性相關。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2015年1月至2017年11月于首都醫科大學附屬北京安貞醫院心血管相關內科病房住院并行冠狀動脈造影檢查的患者1 000例。所有研究對象均為無血緣關系的北方地區的漢族常住居民,簽署知情同意書并同意提供外周血用于檢測。此項研究得到首都醫科大學附屬北京安貞醫院倫理審核委員會的認可。符合世界醫學會赫爾辛基宣言：人體醫學研究的理論原則。

CAD入選標準(CAD組)：有較為典型的心絞痛癥狀且經冠狀動脈造影證實3支主要血管(前降支、回旋支、右冠狀動脈)至少有1支管腔狹窄≥75%。T2D入選標準(T2D組)：≥35歲之后臨床診斷患T2D，需藥物控制血糖(口服降糖藥和/或皮下注射胰島素)>1年且目前仍需使用降糖藥。CAD合并T2D入選標準(CAD+T2D組)：同時符合CAD和T2D的入選標準。對照組入選標準參照既往研究[9]：冠狀動脈造影提示任意血管管腔狹窄<40%，無CAD和/或T2D的病史和客觀證據，無CAD和/或T2D的一級直系親屬，無血糖、糖化血紅蛋白、心肌壞死標志物、心電圖及超聲心動圖異常。

排除標準：①年齡<35歲；②1型糖尿病，糖尿病酮癥酸中毒，高滲性非酮癥糖尿病昏迷，相關的自體抗體陽性；③冠狀動脈造影提示存在心肌橋、冠狀動脈痙攣或擴張，嚴重心力衰竭(心功能Ⅲ～Ⅳ級)、心肌病或先天性心臟病；④繼發性高血壓、原發性腎臟疾病；⑤自身免疫性疾病(如系統性紅斑狼瘡)、癌癥、感染性疾病、嚴重的心臟瓣膜病，嚴重的肝和/或腎功能異常、懷孕或圍產期、目前使用特殊藥物(如糖皮質激素或免疫抑制劑)。

1.2 研究方法

臨床數據的收集：所有的研究對象在22時禁食后，于次日早晨進行人體測量，并采集血液樣本進行相關臨床檢測和DNA提取。對研究對象進行問卷調查，獲得高血壓、高脂血癥和腦梗死病史、用藥史、吸煙或飲酒習慣(回答“完全沒有”的被分為從不吸煙或飲酒)及家族史等。根據歐洲心臟病學會和歐洲高血壓學會高血壓指南[10]，由訓練有素的觀察員測量血壓。體質量指數(body mass index,BMI)是根據個人的身高和體質量(kg/m2)計算出來的。采用超聲心動圖和腹部超聲對相關臟器的功能和結構進行評估。

SNPs的選擇及其分型：取EDTA抗凝的外周血0.5 mL，采用全血DNA試劑盒(北京天一輝遠生命科技有限公司)提取基因組DNA。采用260 nm/280 nm吸光度法測定提取的DNA質量。采用Sanger測序法3730-XL基因分析儀(美國Applied Biosystems)測定SNPs的基因型。

首先對100例CAD合并T2D的DNA樣本進行測序。所選擇的測序區域包括ADIPOR1基因所有外顯子、5′和3′側翼區域上下各1 000 bp。然后，篩選次要等位基因頻率>0.05同時P值<0.3的SNPs(與國際人類基因組單體型圖計劃提供的北京漢族人群相關SNPs的等位基因進行比較，http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)。最終入選以下3個SNPs進行基因分型：rs10581 C>T(位于3′UTR)，rs7539542 G>C(位于3′UTR)及rs7517286 T>C(位于5′UTR)。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 基線資料

通過重新核對出院時的臨床資料以及對各組間的性別、年齡及BMI進行匹配，1 000例樣本中共有737個符合條件并進行了基因分型。最終入選對照組193例，T2D組142例，CAD組203例，CAD+T2D組199例。4組研究對象的臨床及實驗室資料詳見表1。組間比較的結果詳見表2。與對照組相比，CAD組、T2D組及CAD+T2D組有較高比例的高血壓患者(67.1%、67.6%,70.4%vs39.9%,P<0.001)和較低水平的高密度脂蛋白膽固醇(0.96、1.02、0.96 mmol/Lvs1.13 mmol/L,P<0.001)。

表1 4組間臨床基線資料比較Tab.1 Comparison of clinical and demographic characteristics

表2 各組間臨床資料的多重比較Tab.2 Multiple comparison of clinical and demographic characteristics

2.2 SNPs關聯分析

對照組的基因型頻率均符合HWE(PHWE>0.05),詳見表3。測序圖詳見圖1。rs7539542等位基因和基因型頻率在4組間的差異具有統計學意義(P=9.62×10-6和P=3.94×10-4)，詳見表3。通過顯性、隱性及加性遺傳模型分析，rs7539542 C與CAD(OR=1.67～2.34,P=2.87×10-4～0.002)和CAD合并T2D(OR=1.52～2.08,P=0.003～0.016)的易感性相關，與T2D的易感性無明顯關聯(P>0.05),詳見表4。進一步對疾病狀態進行分層分析(表5)，發現rs7539542 C增加T2D患者CAD的易感風險(OR=1.58～2.9,P=0.002～0.038)。rs7517286和rs10581的等位基因間存在連鎖不平衡(圖2)，兩者的等位基因和基因型頻率在4組間的差異均無統計學意義(P>0.05，表3)。

圖2 ADIPOR1基因3個SNPs在對照組中的連鎖不平衡分析圖Fig.2 Linkage disequilibrium plots of 3 SNPs in ADIPOR1 gene in control group SNPs:single nucleotide polymorphisms.

表3 ADIPOR1基因3個SNPs的等位基因和基因型的分布Tab.3 Allelic and genotypic frequencies of 3 SNPs in ADIPOR1 n(%)

如表1所示,3個病例組中高血壓的患病率明顯高于對照組(66.5%vs39.9%,χ2=42.001,P=9.12×10-11)。考慮到高血壓是心血管疾病的影響因素，于是對是否患高血壓進行分層分析。結果顯示在非高血壓亞組，rs7539542 C與CAD(OR=2.03～3,P=0.001～0.008)和CAD合并T2D(OR=1.92～3.3,P=0.004～0.025)的易感性相關，詳見表4,并增加T2D患者CAD的易感風險(隱性模型：P=0.018,OR=4.46；加性模型：P=0.038,OR=1.82)，詳見表5。

表4 ADIPOR1基因rs7539542位點與CAD、T2D及CAD合并T2D的關聯分析Tab.4 Association of rs7539542 in ADIPOR1 with T2D,CAD and T2D with CAD

表5 ADIPOR1基因rs7539542位點與疾病狀態的關聯分析Tab.5 Association of rs7539542 in ADIPOR1 with diseases stratified by CAD or T2D status

rs7539542基因型與高血壓交互作用的P值范圍為0.14～0.86(表6)，提示rs7539542基因型與高血壓無顯著的交互作用。對照組進行高血壓的分層分析，也未發現陽性結果(P值范圍為 0.157～0.263)。

表6 ADIPOR1基因rs7539542位點基因型和高血壓的交互作用Tab.6 rs7539542 genotype-hypertension interaction

2.3 基因與環境的交互作用

采用Logistic回歸分析方法對非高血壓亞組進行基因-環境的交互作用分析。結果顯示，與rs7539542 CG+GG攜帶者相比，rs7539542 CC攜帶者與三酰甘油(triglycerides，TG)存在交互作用，并增加CAD (P=0.041,OR=5.006,95%CI=1.066～23.51)和CAD合并T2D的易感風險(P=0.04,OR=5.381,95%CI=1.081～26.786)。

3 討論

本研究結果提示在中國北方漢族人群中，rs7539542不僅與CAD和CAD合并T2D的易感性有關，還增加T2D患者的CAD易感風險。這一發現與本課題組既往研究[9]結果相一致,rs7539542與中國北方漢族人群的CAD易感性有關。Soccio等[11]對高加索人群的研究提示,rs7539542增加T2D患者的CAD易感風險。然而，本研究不能復制rs7539542與T2D的易感關聯。Qi等[12]的研究顯示,rs7539542(也稱為rs1139646)與女性白種人的T2D易感性有關。但本研究對樣本進行性別分層分析后并未發現上述關聯(結果未列出)。這一陰性關聯與既往在高加索人[13-15]、東亞人(如日本[16]和韓國[17])和非洲[13]人群中的研究結果一致。目前無明確證據提示rs7539542和T2D的易感風險間存在關聯性。也就是說，rs7539542與CAD的易感性關聯可能獨立于T2D。

考慮到3個病例組樣本中高血壓的患病率較高，故對血壓進行分層分析，結果表明與總體樣本一致的結論僅出現在非高血壓亞組。因高血壓被認為是CAD主要的傳統危險因素之一，不除外與rs7539542存在交互作用。故在各病例組間對rs7539542基因型與血壓的交互作用進行檢測，還在對照組中對血壓進行分層分析，結果未發現rs7539542與血壓之間有顯著的交互作用。這提示rs7539542與CAD的易感性關聯可能獨立于血壓的影響。

環境因素在慢性代謝性疾病的發生發展中起著重要的作用，并可能影響基因對疾病的表型。因此，在非高血壓病例組中，進一步分析了基因與環境因素的交互作用。結果顯示，rs7539542 CC基因型與TG存在交互作用，增加CAD、CAD合并T2D的易感風險(OR分別為5.006和5.381)。可以看出，與rs7539542單獨分析相比，rs7539542聯合TG后明顯增加CAD和CAD合并T2D的相對風險(即OR值)。在高脂血癥中，除低密度脂蛋白膽固醇外，高濃度的TG也被認為是CAD的危險因素[18]。血漿低濃度的脂聯素[1]和ADIPOR1多態性[18]與高濃度的TG相關。因此是否對rs7539542風險基因攜帶者進行早期血脂篩查并強化降脂治療有待進一步研究。

本研究存在一些局限性。一方面缺乏功能學研究，例如檢測rs7539542 microRNA，進一步檢驗rs7539542是否是影響CAD遺傳基礎的功能變異位點。尤其是既往研究[11]顯示,rs7539542影響ADIPOR1基因的表達。另一方面，本研究樣本量不足可能降低了檢驗效能，尤其在亞組或分層分析中。但本研究具有嚴格的入排標準，并通過入選極端表型來增強檢測等位基因差異的能力。如CAD組入選標準為具有較為典型的心絞痛癥狀且冠狀動脈造影證實為主要血管至少有1支管腔狹窄≥75%，并非傳統意義的以管腔狹窄≥50%為入選標準，同時除外了心肌橋、冠狀動脈痙攣及嚴重擴張等非動脈粥樣硬化造成管腔狹窄的情況；再如T2D入選標準為需藥物控制血糖>1年且目前仍需使用降糖藥，除外輕型(如通過運動和飲食即可控制血糖)、一過性、藥物源性或相關抗體陽性的血糖增高患者。此外，本研究在各組間對一些如性別、年齡及BMI等CAD和T2D的傳統危險因素進行了匹配，盡可能降低了混雜因素對結果的影響。考慮到CAD和T2D均為慢性復雜性疾病，受多基因和環境因素的相互影響，故ADIPOR1基因單多態位點在CAD和T2D發生發展中的作用及其臨床應用價值尚需進一步研究。

綜上所述，通過多病例-對照的研究方法，本研究發現了位于ADIPOR1基因非內含子區域的rs7539542多態位點不僅與CAD和CAD合并T2D的易感性相關，還增加T2D患者CAD的易感風險，尤其是在非高血壓患者中。此外，rs7539542與TG存在交互作用，進一步提高了CAD和CAD合并T2D的易感風險。本研究結果有助于進一步研究ADIPOR1基因在CAD發生發展中的作用。