不同正畸力值對(duì)哺乳期大鼠正畸牙周組織中HO-1 CC類趨化因子受體1及其配體的影響

焉宏軍 王榮強(qiáng) 張雯姝

正畸即對(duì)錯(cuò)牙合畸形進(jìn)行糾正，牙合畸形患者可通過正畸達(dá)到美容效果[1]。抗缺氧、抗炎蛋白血紅素氧合酶(Heme Oxygenase-1，HO-1)是組織內(nèi)有效的抗氧化劑。HO-1可能在牙髓血流調(diào)控、牙本質(zhì)形成及牙髓細(xì)胞代謝和分化中起調(diào)控作用[2-3]。CC趨化因子受體1(CC-chemokine receptor 1，CCR1)及其相關(guān)配體表達(dá)與正畸牙移動(dòng)過程及牙周骨改建相關(guān)[4]。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)是破骨細(xì)胞的特征酶，其表達(dá)和分泌與破骨細(xì)胞功能密切相關(guān)，TRAP陽性細(xì)胞的位置和水平與乳牙生理性的根吸收進(jìn)程密切相關(guān)[5]。有研究[6]顯示，哺乳期患者正畸牙移動(dòng)速率較非哺乳者加快。為提高哺乳期正畸患者的正畸效果，本文制備哺乳期大鼠模型，擬探討不同正畸力值對(duì)大鼠牙周組織中HO-1、CC類趨化因子受體1及其配體的影響，以期為臨床哺乳期正畸患者制定最佳正畸治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇3月齡Wistar大鼠126只(均購自遼寧大連實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公共服務(wù)平臺(tái)-實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，其中雌性96只，雄性30只，SPF級(jí)，平均體質(zhì)量(200±20)g，分籠飼養(yǎng)，定時(shí)給予磨碎的固體飼料，飲消毒清水，每12 h間隔照明，控制室溫18～23°C、濕度在56%、室內(nèi)噪音60 dB以下，同時(shí)定期進(jìn)行紫外線消毒及通風(fēng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間記錄每只大鼠的狀態(tài)。

1.2 主要儀器及試劑 0.20 mm結(jié)扎絲(杭州晨陽正畸材料廠)，0.012 inch×9 mm鎳鈦螺旋彈簧(北京圣瑪特科技有限公司)，光固化樹脂和樹脂粘結(jié)劑(美國MEDENTAL國際齒科機(jī)關(guān))，桿式測(cè)力計(jì)(杭州奧杰醫(yī)療器械有限公司)，微型牙科技工打磨機(jī)(韓國世新精密株式會(huì)社)，雙能X線骨測(cè)量密度儀(美國Hologic公司)，高溫高壓真空消毒爐(蘇州順美口腔醫(yī)療設(shè)備有限公司)，Cobas e601免疫分析儀(德國羅氏診斷公司)，兔抗大鼠HO-1多克隆抗體(美國CST公司，貨號(hào)：86806)，F(xiàn)astPrep儀(美國MP醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司)，7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Life technologies公司)。

1.3 方法

1.3.1 哺乳期大鼠模型制備 采用陰道涂片法確定大鼠的動(dòng)情周期，將大鼠呈臥位固定后用20 μL生理鹽水對(duì)陰道進(jìn)行灌注，在反復(fù)吹打3～4次后滴至載玻片上，在40倍鏡下觀察，從而確定大鼠的動(dòng)情周期。在大鼠動(dòng)情前期，按照雌雄1∶1的比例合籠，清晨制備涂片鏡下檢查發(fā)現(xiàn)孕栓后，即確定雌鼠為妊娠狀態(tài)。之后進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，大鼠自然分娩后通過母乳喂養(yǎng)仔鼠，喂養(yǎng)4周后斷奶，此時(shí)認(rèn)定哺乳期模型鼠制備成功。共成功制備72只哺乳期模型大鼠。

1.3.2 不同正畸力值干預(yù) 將此72只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為0N組、0.29N組、0.49N組和0.98N組，每組18只。根據(jù)分組依次給予0 N、0.29 N、0.49 N及0.98 N正畸力。具體操作：分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行全身麻醉，麻醉劑為3.3 mL/kg的水合氯醛，之后用開口器將大鼠口腔撐開，采用尖頭的金剛砂車針在右上第一磨牙近牙頸部頰舌面進(jìn)行打磨，直至磨出0.5 mm槽溝，再穿一根結(jié)扎絲經(jīng)過第一、二磨牙臨近點(diǎn)的下降，結(jié)扎、固定第一磨牙，一端連接鎳鈦螺旋彈簧，在大鼠的切牙亞冠頰舌面、遠(yuǎn)中面磨出一0.5 mm槽溝，之后將結(jié)扎絲嵌入溝內(nèi)，連接2個(gè)中切牙為一個(gè)整體，連接螺旋彈簧的另一端，之后清潔、隔濕中切牙，牙面涂抹上釉質(zhì)酸蝕劑，之后停留30 s再?zèng)_洗吹干，再涂抹樹脂粘結(jié)劑，光固化樹脂封閉、固定切牙牙頸部，以防結(jié)扎絲松動(dòng)、脫落，增強(qiáng)支抗。采用測(cè)力計(jì)測(cè)量NiTi彈簧拉伸的力量，確保各組大鼠符合所設(shè)定的正畸力值。每日檢查一次加力裝置是否完整，如有脫落、損壞情況，及時(shí)修理、安裝。

1.4 觀察指標(biāo) 比較給予不同正畸力值的4組大鼠在干預(yù)前1天及干預(yù)第1、3、7天后的CCR1及其配體(CCL3、CCL5)mRNA相對(duì)表達(dá)量，HO-1水平及TRAP破骨細(xì)胞染色水平。

1.4.1 CCR1及CCL3、CCL5 mRNA檢測(cè) 每個(gè)組選取6只大鼠麻醉后用Rnase-free溶液對(duì)心臟進(jìn)行灌注，之后將第一磨牙拔除，取下牙周膜及牙槽骨，將其置入1.5 mL Rnase-free離心管中，再加入1 mL Trizol試劑，分別用FastPrep儀將組織磨碎、勻漿后用Fastprep程序?qū)俁NA進(jìn)行提取。采用7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成引物，之后每個(gè)基因做3個(gè)復(fù)管，對(duì)目的基因及β-actin用SYBR綠色熒光定量系統(tǒng)性實(shí)時(shí)熒光定量PCT擴(kuò)增，條件為95°C下2 min，之后以95°C下10 s、60°C下30 s、70°C下30 s各行40個(gè)循環(huán)。計(jì)算各指標(biāo)相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 牙周組織中HO-1水平的檢測(cè) 在每組剩余的12只大鼠中選取6只，采用SP法檢測(cè)HO-1水平：牙周組織處理方法同上，兔抗大鼠多克隆HO-1抗體稀釋濃度為1∶100，生物素山羊抗兔IgG(美國CST公司，貨號(hào)：7054)作為二抗(稀釋度1∶100)，之后行組織切片，常規(guī)脫蠟入水后用微波加熱法對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)，DAB進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，之后進(jìn)行封片，陰性對(duì)照用磷酸緩沖鹽代替一抗，其他條件相同，陽性表達(dá)為細(xì)胞胞漿呈棕黃色顆粒狀改變。每張取5個(gè)400×高倍視野，表達(dá)強(qiáng)度呈色用平均吸光度(optical density，OD)表示。

1.4.3 TRAP破骨細(xì)胞染色 將各組剩余的6只大鼠，靜脈采血，離心取血清，使用人骨純化的破骨細(xì)胞兔抗大鼠TRAP/CD40單克隆抗體(美國CST公司，貨號(hào)：15094)，通過抗酒石酸酸性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：P0332)測(cè)定TRAP表達(dá)，具體步驟按照說明書進(jìn)行操作。取大鼠第一磨牙壓力側(cè)牙牙周膜的近牙骨質(zhì)側(cè)牙周組織，在光鏡下觀察壓力側(cè)牙周組織的形態(tài)學(xué)變化，，并在400倍物鏡下通過OBI200高清晰度彩色病理分析系定量分析TRAP陽性破骨細(xì)胞陽性面積。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠CCR1 mRNA表達(dá)量比較 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠CCR1 mRNA表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)前1天，各組CCR1mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)第1、3天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCR1 mRNA表達(dá)量較0N組均增加(P<0.05)，0.49N組及0.98N組CCR1 mRNA表達(dá)量較0.29N組均增加(P<0.05)，但0.49N組和0.98N組CCR1 mRNA表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)第7天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCR1 mRNA表達(dá)量較0N組均增加(P<0.05)，但該3組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠CCR3 mRNA表達(dá)量比較 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠CCR3 mRNA表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)前1天，各組CCR3 mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)第1、3天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCR3 mRNA表達(dá)量較0N組均增加(P<0.05)；0.49N組和0.98N組的CCR3 mRNA表達(dá)量較0.29N組均增加(P<0.05)，但0.49N組及0.98N組該指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)第7天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCR3 mRNA表達(dá)量較0N組均增加(P<0.05)，與0.29N組比較，0.98N組CCR3 mRNA表達(dá)量增加(P<0.05)，而0.49N組和0.98N組CCR3 mRNA表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠CCR3mRNA表達(dá)量比較

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠CCL5 mRNA表達(dá)量比較 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠CCL5 mRNA表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)前1天，各組CCL5 mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)第1～7 天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCL5 mRNA表達(dá)量較0N組均增加(P<0.05)；0.49N組和0.98N組CCL5 mRNA表達(dá)量較0.29N組均增加，而0.49N組和0.98N組該指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠CCL5mRNA表達(dá)量比較

2.4 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠牙周組織中HO-1的OD值比較 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠牙周組織中HO-1的OD值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)前1天，4組大鼠牙周組織中HO-1 的OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)第1天，0.29N組、0.49N組及0.98N組HO-1 的OD值較0N組均增加(P<0.05)，0.49N組和0.98N組HO-1的OD值較0.29N組均增加(P<0.05)，而0.49N組和0.98N組此指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠牙周組織中HO-1 的OD值比較

2.5 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠破骨細(xì)胞染色陽性面積比較 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠破骨細(xì)胞染色陽性面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)前1天，4組破骨細(xì)胞染色陽性面積差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)第1、3天，0.29N組、0.49N組及0.98N組破骨細(xì)胞染色陽性面積較0N組均增加(P<0.05)，0.49N組、0.98N組破骨細(xì)胞染色陽性面積較0.29N組均增加(P<0.05)，而0.49N組和0.98N組此指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠破骨細(xì)胞染色陽性面積比較

3 討論

正畸是給予牙齒一定時(shí)間、一定強(qiáng)度的機(jī)械外力，從而使得牙齒發(fā)生移動(dòng)，其中包括牙周組織、包繞牙根的牙槽骨發(fā)生改建，從而使牙齒可以移動(dòng)到新位置[7-8]。機(jī)械外力作用下正畸牙移動(dòng)的生物學(xué)基礎(chǔ)是牙周組織改建，而與該過程密切相關(guān)的細(xì)胞為破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞，因此在牙根、牙周組織、牙髓無可逆性損傷情況下采用合適的力值促使正畸牙齒移動(dòng)是正畸治療的重點(diǎn)[9-10]。另外，患者身體狀況、年齡、加力時(shí)間、加力大小、頻率及牙槽骨密度等均會(huì)對(duì)正畸牙齒移動(dòng)速度產(chǎn)生影響[11]。有報(bào)道[12]顯示，哺乳期患者正畸牙移動(dòng)速率較非哺乳者快。本文制備哺乳期大鼠模型，擬探討不同正畸力值對(duì)哺乳期大鼠正畸牙周組織中HO-1、CC類趨化因子受體1及其配體的影響，以期為哺乳期正畸患者治療方案的選擇，提高正畸效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

臨床正畸牙齒移動(dòng)的最佳力值為0.98 N，而大鼠磨牙是人磨牙的1/50，因此0.19N左右是較為合適的正畸力值[13]；有研究[14]發(fā)現(xiàn)，在0.39～0.59N初始力下可以觀察到大鼠牙齒移動(dòng)，因此本研究選擇0N、0.29N、0.49N及0.98N的正畸力值。本組資料顯示，干預(yù)后第1、3天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCR1、CCR3和CCL5 mRNA表達(dá)量及破骨細(xì)胞染色陽性面積較0N組均明顯增加(P<0.05)，0.49N組及0.98N組CCR1、CCR3和CCL5 mRNA表達(dá)量、破骨細(xì)胞染色陽性面積均較0.29N組明顯增加(P<0.05)。以上結(jié)果表明，隨著正畸力值的增加，哺乳期大鼠的HO-1、CC類趨化因子受體1及其配體、TRAP破骨細(xì)胞染色陽性面積均發(fā)生顯著變化，其中0.49N及0.98N時(shí)以上指標(biāo)變化幅度較大，即干預(yù)效果最顯著，分析原因：CCR1控制前體成骨與破骨細(xì)胞的分裂、分化、活化，其在成骨細(xì)胞、原始骨髓細(xì)胞、RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及破骨前體細(xì)胞中均有表達(dá)[15-16]。相關(guān)研究[2,17]證實(shí)，正畸力和患者機(jī)體內(nèi)環(huán)境共同影響牙周組織的改建過程，如哺乳期患者正畸牙移動(dòng)速率較未哺乳組加快，其原因可能與哺乳期患者牙槽骨密度降低有關(guān)。因此推測(cè)，CCR1可通過調(diào)控牙周組織成骨與破骨細(xì)胞分化從而參與牙周骨組織改建過程，與前人研究[4]結(jié)論相似。另外，干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)，0.49N組及0.98N組CCR1、CCR3和CCL5 mRNA表達(dá)量及破骨細(xì)胞染色陽性面積比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。即0.49N組和0.98N組正畸力值不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)效果變化相對(duì)不明顯。提示0.49N和0.98N正畸力值具有同樣的正畸效果。由此可想，對(duì)哺乳期大鼠干預(yù)的正畸力值并非越大越好，0.49N可能是本研究大鼠的最適正畸力。

綜上所述，正畸干預(yù)可通過促進(jìn)哺乳期大鼠牙周組織中HO-1、CC類趨化因子受體1及其配體的表達(dá)發(fā)揮作用，但0.49N是否是哺乳期大鼠進(jìn)行干預(yù)的最佳正畸力值有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。