白芍總苷對缺血性腦損傷大鼠腦保護作用的研究

王 麗

腦血管病具有高發生率、高致殘率和高致死率，流行病學調查顯示，腦血管病在世界范圍內60歲以上人群中居致死疾病譜第2位，在我國居首位，嚴重威脅著人類的生命健康[1, 2]。腦血管病患者中約85%為缺血性腦病，即腦血流障礙導致腦組織局部缺血性壞死，其疾病進展過程涉及氧化應激、鈣超載、細胞凋亡等多種病理機制[3～6]。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從毛茛科植物芍藥的干燥根(中藥白芍)中提取的一類活性化合物，包括芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內酯苷等，現代藥理學研究發現TGP具有良好的抗氧化、抗炎、抑制細胞凋亡等多種藥理學作用[7, 8]。本研究將探討TGP對缺血性腦損傷大鼠腦組織的保護作用。

材料與方法

1.實驗動物與分組：240只無特定病原微生物級雄性SD大鼠，7周齡，體質量240±20g，購自河北省實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(冀)2018-004；適應性飼養1周(12h晝夜交替，室溫25±1℃)后開展實驗。按數字表法隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平(nimodipine，NMP)10mg/(kg·d)組和TGP 50、100、200mg/(kg·d)組，每組40只。

2.藥物與試劑：TGP膠囊(寧波立華制藥有限公司，規格0.3克/粒)；NMP膠囊(浙江海力生制藥有限公司，規格：20毫克/粒)；伊文思藍(國藥集團化學試劑有限公司)；氧化應激指標試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TUNEL染色試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司)。

3.給藥與模型制備：(1)給藥：精確稱取TGP膠囊與NMP膠囊內容物并分別加入適量0.9%氯化鈉注射液制備濃度10、20、40mg/ml的TGP溶液和濃度2mg/ml的NMP溶液；TGP 50、100、200mg/(kg·d)組于造模前7天開始分別1次/天給予濃度為10、20、40mg/ml的TGP溶液(5ml/kg)灌胃，NMP 10mg/(kg·d)組給予2mg/ml的NMP溶液灌胃，假手術組和模型組分別同步給予0.9%氯化鈉注射液(5ml/kg)。(2)模型制備：參照王新鳳等[9]的報道采用線栓堵塞右側大腦中動脈的方法制備缺血性腦損傷大鼠模型；假手術組除不插入線栓外，其余操作同模型組。造模術后24h行各指標檢測。

4.神經功能評估與腦組織BBB通透性檢測：(1)每組大鼠隨機取10只，由兩位經過相關培訓的實驗人員參照Zausinger等[10]報道的六分法獨立進行神經功能評分，取平均值。(2)尾靜脈注射4ml/kg伊文思藍溶液(濃度2%)，1h后麻醉、開胸、由左心室-右心耳通路快速灌注300ml 0.9%氯化鈉注射液，斷頭取右側大腦，研磨勻漿后加3倍量50%的甲酰胺溶液，60℃孵育24h后3000r/min離心10min取上清液，應用酶標儀檢測610nm波長處吸光度值，參照標準曲線計算伊文思藍含量，伊文思藍含量可反映BBB通透性。

5.腦組織含水量測定：各組另隨機取10只大鼠，麻醉后斷頭取腦、稱量右側腦組織(W濕)，110℃烘烤至恒重后稱重(W干)，含水量(%)=[(W濕-W干)/W濕]×100%

6.腦組織病理學檢查和神經細胞凋亡觀察：各組另隨機取10只大鼠，麻醉后，由左心室-右心耳通路灌注300ml 0.9%氯化鈉注射液、300ml 4%多聚甲醛溶液，斷頭取腦、置4%多聚甲醛溶液固定72h，行石蠟包埋、切片、梯度乙醇脫蠟。行HE染色，梯度乙醇脫水后中性樹膠封片，通過光學顯微鏡觀察腦組織病理學改變；按照TUNEL試劑盒操作說明處理，封片后通過光學顯微鏡觀察，凋亡指數(AI)計算：每張切片于缺血區皮質隨機選取5個互不重疊的視野計數細胞總數和陽性細胞數，取平均值，AI(%)=(陽性細胞數/細胞總數)×100%。

7.腦組織氧化應激指標檢測：取各組剩余10只大鼠，麻醉后斷頭取腦，于冰上切取右側大腦、剪碎后加入9倍量4℃冷裂解液研磨勻漿，3000r/min離心10min后取上清液，然后采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性、高錳酸鉀滴定法測定CAT活性、硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

8.統計學方法：采用SPSS 15.0統計學軟件對數據進行統計分析，多組間比較行單因素方差分析，兩組間比較行獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.TGP對缺血性腦損傷大鼠神經功能和BBB通透性的影響：與假手術組比較，模型組大鼠Zausinger評分顯著降低、伊文思藍滲透量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TGP 100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)組Zausinger評分顯著升高、伊文思藍滲透量顯著降低(P<0.05)；與NMP 10mg/(kg·d)組比較，TGP 200mg/(kg·d)組Zausinger評分升高且伊文思藍滲透量降低(P<0.05)，詳見表1。

2.TGP對缺血性腦損傷大鼠腦含水量的影響：與假手術組比較，模型組大鼠腦組織含水量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TGP 100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)組腦組織含水量顯著降低(P<0.05)；TGP 200mg/(kg·d)組腦含水量與NMP 10mg/(kg·d)組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

3.TGP對缺血性腦損傷大鼠腦組織病理學改變的影響：假手術組大鼠腦皮質神經細胞形態結構未見異常；模型組大鼠腦組織皮質神經元數量減少、排列疏松、間隙增大、胞核固縮、胞質著色不均勻、出現空泡性改變等病理學改變；TGP 50、100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)組上述病理學改變呈不同程度改善，其中TGP 200mg/(kg·d)組效果相對較優,詳見圖1。

圖1 TGP對缺血性腦損傷大鼠腦組織病理學改變的影響(HE，×200)A.假手術組；B.模型組；C.TGP 50mg/(kg·d)預處理組；D.TGP 100mg/(kg·d)預處理組；E.TGP 200mg/(kg·d)預處理組；F.NMP 10mg/(kg·d)預處理組

4.TGP對缺血性腦損傷大鼠神經細胞凋亡的影響：假手術組大鼠腦皮質僅可見極少量凋亡細胞；模型組神經細胞凋亡數量明顯增多，AI顯著高于假手術組(49.26%±7.13% vs 2.81%±0.57%，P<0.01)；與模型組比較，TGP 50、100、200mg/(kg·d)和NMP 10mg/(kg·d)組AI顯著降低(42.51%±5.60%、34.09%±4.82%、22.58%±3.94%、26.91%±4.16% vs 49.26%±7.13%，P<0.05)；與NMP 10mg/(kg·d)組比較，TGP 200mg/(kg·d)組AI顯著降低(22.58%±3.94% vs 26.91%±4.16%，P<0.05)，詳見圖2。

5.TGP對缺血性腦損傷大鼠腦組織氧化應激的影響：與假手術組比較，模型組大鼠腦組織SOD、CAT活性顯著降低且MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TGP 100、200mg/(kg·d)組和NMP 10mg/(kg·d)組SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低(P<0.05)；與NMP 10mg/(kg·d)組比較，TGP 200mg/(kg·d)組SOD活性顯著升高且MDA含量顯著降低(P<0.05)，詳見表2。

圖2 TGP預處理對缺血性腦損傷大鼠腦神經細胞凋亡的影響(TUNEL，×200)A.假手術組；B.模型組；C.TGP 50mg/(kg·d)預處理組；D.TGP 100mg/(kg·d)預處理組；E.TGP 200mg/(kg·d)預處理組；F.NMP 10mg/(kg·d)預處理組

討 論

人大腦重量約占體重的2.5%～3.0%，卻約占全身耗氧量的25%，腦缺血5min以上即可出現不可逆損傷，最終致殘甚至致死。所以，高危人群預防及發病后及早治療以減輕缺血早期腦組織損傷對降低病死率、改善預后具有重要意義。病理學研究發現，腦組織供血不足將導致線粒體能量代謝障礙、ATP合成受阻而引發活性氧簇(ROS)大量生成，既往研究發現，通過藥物抑制氧化應激對缺血性腦損傷大鼠具有一定的保護作用[11～13]。TGP為中藥白芍的主要活性成分，具有良好的抗氧化、抗凋亡作用，本研究結果顯示，經TGP預處理能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠神經功能缺損，抑制腦組織形態結構病變和神經細胞損傷，抑制神經細胞凋亡，提示TGP對缺血性腦損傷大鼠腦組織具有保護作用。

BBB主要是由內皮細胞結合跨膜蛋白、胞質附著蛋白、骨架蛋白等相互作用形成的三維網狀超微結構，能夠阻止有害高分子物質由血管進入腦組織，對維持中樞神經內環境穩定具有重要意義[14]。BBB通透性升高是血管源性腦水腫的主要原因，而腦水腫是缺血性腦病致殘、致死的重要病理基礎[15, 16]。生理狀態下伊文思藍不能通過BBB，但當BBB結構受損、通透性升高時伊文思藍則可進入腦組織，所以伊文思藍滲透量能夠反映BBB通透性[17]。本研究結果顯示，經TGP預處理能夠抑制腦組織伊文思藍含量和含水量的升高，提示TGP對缺血性腦損傷大鼠BBB通透性具有保護作用，對腦水腫具有抑制作用。

腦組織血氧供應不足導致ROS大量生成，以ROS為底物的還原酶SOD、CAT過度消耗，致使ROS過剩而攻擊核酸、蛋白質等產生具有細胞毒性的MDA[18]。此外，ROS將攻擊細胞骨架，破壞BBB結構導致其通透性升高[19, 20]。本研究結果顯示，經TGP預處理能夠抑制SOD、CAT活性的降低和MDA含量的升高，提示TGP對缺血性腦損傷大鼠腦組織氧化應激損傷具有抑制作用。

綜上所述，TGP對缺血性腦損傷大鼠腦組織具有一定的保護作用，其機制可能與抑制氧化應激、保護BBB通透性、抑制腦水腫有關。