糖心平膠囊藥效及急性毒性實驗觀察

李曉文 林 蘭 倪 青 黃 達 王 澤

糖心平膠囊(tangxinping capsule, TXPC)是由中國中醫科學院廣安門醫院內分泌科主任醫師、首席研究員林蘭根據其多年臨床經驗，在觀察和總結了糖尿病心臟病基本病機的基礎上，研制出的具有益氣養陰、活血化瘀作用的中藥制劑，用于糖尿病心臟病的治療。TXPC組方以黃芪、太子參、五味子、水蛭、香加皮等為主。前期研究證實，TXPC具有良好的改善糖尿病心臟病心肌細胞能量代謝及血液流變，抗心肌纖維化等作用。為進一步擴大TXPC的臨床應用，本研究通過進行糖心平膠囊的藥效研究及急性毒性實驗，確定其藥效及安全用藥范圍，為臨床治療提供參考。

材料與方法

1.藥品：TXPC藥粉(中國中醫科學院廣安門醫院新藥研發辦公室提供，生產批次：20181110)、蒸餾水(用于實驗中藥液配置)。鹽酸二甲雙胍(格華止)由中美上海施貴寶制藥有限公司生產，500毫克/片×20片/盒，生產批號：國藥準字H20144480。

2.動物：SPF級雄性SD大鼠90只，體質量160±20g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[實驗動物許可證號SCXK(京)：2016-0001]，實驗前先用普通飼料適應性飼養1周。SPF級健康昆明種小鼠，體質量18～20g，雌雄各半共40只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[實驗動物許可證號SCXK(京)：2019-0008]，普通清潔維持飼料喂養，以上動物均飼養于中國中醫科學院廣安門醫院SPFⅡ級實驗動物中心。飼養環境：通風良好、光照規律(各12h)、環境清潔(SPF清潔設施)、溫、濕度穩定(溫度22±2℃、濕度40%～70%)、標準動物飲用水。

3.試劑及儀器：脲佐菌素(streptozotocin, STZ)(美國Sigma公司)、無水檸檬酸鈉、無水檸檬酸鈉；AB135-S型電子天平(瑞士METTLER公司)、AccU-Chek Active血糖儀(GB型)、灌胃針、濾紙、pH試紙。

4.TXPC藥效學實驗：取上述SD大鼠90只，在適應性飼養1周后，隨機分為正常飲食組10只和高脂飼料飲食組80只，高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司提供，配料：68%常規飼料、10%蔗糖、10%蛋黃粉、10.1%豬油、1.5%膽固醇、0.4%膽酸鹽)，各組大鼠分別喂養4周后，高脂飲食組大鼠一次性予35mg/kg STZ(使用2.1%的檸檬酸與2.94%的檸檬酸按照1∶1.32的比例制備成緩沖液，pH 4.2～4.5)腹腔注射，正常飲食組大鼠予35mg/kg檸檬酸緩沖液腹腔注射。STZ注射72h后(禁食12h)尾靜脈采血測定FBG水平，FBG≥11.1mmol/L，即認為T2DM模型成功，按照此標準高脂組有60只大鼠造模成功。將上述造模成功的大鼠，按照血糖值隨機分成模型組、糖心平高、中、低劑量組及二甲雙胍組，每組各12只。正常對照組大鼠10只。分組后連續給藥6周，每周測1次體質量，按照體質量計算灌胃量(按照7倍體表面積折算法)。正常對照組(Normal組)：每日0.9% NaCl溶液1ml/100g灌胃；模型對照組(Model組)：每日0.9% NaCl溶液1ml/100g灌胃，以上兩組均使用普通詞料自由飲水；糖心平低劑量組(TXPD組)：每日0.21g/kg TXPC藥粉水溶液水1ml/100g灌胃，相當于成人每日給藥劑量的3.5倍； 糖心平中劑量組(TXPZ組)：每日0.42g/kg TXPC藥粉水溶液水1ml/100g灌胃，相當于成人每日給藥劑量的7倍；糖心平高劑量組(TXPG組)：每日0.84g/kg TXPC藥粉水溶液水1ml/100g灌胃，相當于成人每日給藥劑量的14倍；二甲雙胍組(Met組)：每日0.15g/kg二甲雙胍藥粉水溶液水1ml/100g灌胃。上述4組大鼠均使用高脂飼料喂養同時自由飲水。

5.TXPC急性毒性實驗：最大給藥量預實驗：取上述小鼠40只，雌雄各半，禁食不禁水12h后按體質量隨機分為給藥組和對照組，雌雄分開10只一籠飼養。取TXPC生藥藥粉溶解于蒸餾水中，按照灌胃針可吸取的最大液體濃度測得最大給藥濃度為0.18g/ml。采用0.18g/ml的濃度TXPC藥粉溶液，按照0.4ml/10g的最大給藥量，對給藥組小鼠進行一次性灌胃，對照組給同等體積的蒸餾水灌胃，觀察7天。最大給藥量正式實驗：取上述小鼠40只，禁食不禁水12h后按體質量隨機分為給藥組和對照組，每組20只，雌雄各半,10只一籠飼養。給藥組采用最大給藥濃度0.18g/ml的藥液，按照0.4ml/10g小鼠體質量的最大給藥量進行灌胃，灌胃給藥3次，間隔8h，對照組按照同樣的方法，每次給予同等體積的蒸餾水灌胃。最后1次給藥2h后，恢復正常飲食，連續觀察14天。

6.毒性實驗觀察方法：各組灌胃給藥后，雌雄分開每籠10只，正常飼養。最后一次給藥后2h內，每15min觀察1次；給藥后2～4h內，每30min觀察1次；給藥后4～8h內，每1h觀察1次；給藥后8～24h內，每4h觀察1次；給藥后第2天起，每天觀察1次，稱取體質量及進食量，密切觀察各小鼠的呼吸和運動狀態等，記錄觀察周期之內可能出現的毒性不良反應和死亡情況。對死亡和實驗結束時存活小鼠進行大體剖檢，肉眼觀察各臟器有無異常，如有肉眼可見病變，進行組織病理學檢查。

結 果

1.TXPC藥效實驗結果

(1)TXPC對T2DM大鼠血糖的影響：糖心平膠囊治療4周后，與模型組比較，糖心平高劑量組及二甲雙胍組血糖明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)。6周時，與模型組比較，各組血糖均有不同程度的下降，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

組別n給藥量0周(mmol/L)2周(mmol/L)4周(mmol/L)6周(mmol/L)對照組10-6.10±0.855.86±0.676.20±1.005.92±1.26模型組12-16.25±1.60?16.87±1.57?17.93±2.53?18.20±2.16?TXPD120.2116.81±2.0717.58±2.3716.40±2.0216.15±2.68#TXPZ120.4216.23±2.1516.94±1.4016.36±2.0215.76±2.06#TXPG120.8416.20±1.3415.78±1.2015.37±2.10##14.81±2.44##二甲雙胍組120.1516.39±1.7213.90±1.80##12.19±1.19##10.04±2.09##

(2)TXPC對T2DM大鼠TG、TC、INS、TXB2的影響：治療后糖心平中、高劑量組及二甲雙胍組TG、TC均顯著降低；糖心平高劑量組INS水平明顯下降且治療后糖心平各組的TXB2水平下降明顯，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

組別nTG(mmol/L)TC(mmol/L)INS(IU/ml)TXB2(pg/ml)對照組100.95±0.201.34±0.0817.47±3.6640.40±4.99模型組121.53±0.20?1.60±0.12?27.80±8.49?57.04±6.19?TXPD121.40±0.171.47±0.11#25.24±7.2150.49±8.67#TXPZ121.37±0.13#1.46±0.10##23.43±5.9950.13±4.46#TXPG121.34±0.13#1.44±0.09##21.15±6.65#48.76±4.51##二甲雙胍組121.21±0.10##1.44±0.11##19.92±4.59#53.30±6.86

組別nTG(mmol/L)TC(mmol/L)INS(IU/ml)TXB2(pg/ml)對照組100.95±0.201.34±0.0817.47±3.6640.40±4.99模型組121.53±0.20?1.60±0.12?27.80±8.49?57.04±6.19?TXPD121.40±0.171.47±0.11#25.24±7.2150.49±8.67#TXPZ121.37±0.13#1.46±0.10##23.43±5.9950.13±4.46#TXPG121.34±0.13#1.44±0.09##21.15±6.65#48.76±4.51##二甲雙胍組121.21±0.10##1.44±0.11##19.92±4.59#53.30±6.86

與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

(3)TXPC對T2DM大鼠ET-1、BNP、CKMB、6KPG的影響：糖心平膠囊治療后各組ET-1水平均明顯降低，其中高劑量組降低作用尤為顯著(P<0.01)；與模型組比較，糖心平中、高劑量組BNP(P<0.01)及CKMB(P<0.05)水平均明顯降低；其中糖心平高劑量組及二甲雙胍組6KPG明顯降低(P<0.05，表3)。

組別nET-1(ng/ml)BNP(pg/ml)CKMB(U/L)6KPG(pg/ml) 對照組100.23±0.10 59.80±13.08916.00±201.160.83±0.10 模型組120.60±0.09?145.57±15.05?1551.00±125.65?0.68±0.08?TXPD120.48±0.12#126.87±22.161384.40±117.480.72±0.07TXPZ120.48±0.12#120.87±19.06##1379.70±184.64#0.75±0.06 TXPG120.46±0.11##116.85±19.83##1349.56±170.65#0.78±0.09#二甲雙胍組120.41±0.08##125.65±20.30#1416.75±158.920.79±0.10##

2.TXPC急性毒性實驗結果

(1)預實驗結果：在末次給藥后連續觀察的7天內，對照組動物一般狀態良好，未見由于灌胃引起的異常癥狀；給藥組小鼠出現輕度的惡心、怠動的癥狀，2h后癥狀基本消失，一般狀態良好，未出現動物死亡，故以該最大濃度進行最大給藥量實驗。

(2)最大給藥量實驗結果：本研究給藥日及藥后連續觀察14天，實驗當天給藥組動物出現一定程度的倦怠和俯臥不動癥狀，2h后癥狀基本消失。對照組動物一般狀態良好，詳見表4。

表4 毒性實驗觀察指標及小鼠行為記錄

(3)小鼠體質量測定結果： 實驗期間各組動物體質量均勻增長，組間比較差異無統計學意義(P>0.05，表5)。

組別性別n第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天第10天第14天對照組1023.092±0.46724.789±0.89325.500±0.88627.022±1.13427.534±1.19028.050±1.20829.405±1.56230.459±1.53631.880±1.443給藥組雌1022.968±1.03023.900±1.60424.853±1.32125.874±1.39626.784±1.04227.324±1.42128.581±1.37729.239±1.67630.487±1.510對照組1023.388±0.66525.661±1.16926.823±1.16328.513±1.17431.403±1.57432.705±1.86334.203±2.05835.564±2.38735.771±2.487給藥組雄1023.166±0.75525.135±1.11227.919±1.31027.919±1.31030.639±1.29531.528±2.14233.349±1.72435.293±1.85934.981±2.216

(4)小鼠進食量測定結果：實驗期間給藥組及對照組小鼠的進食及飲水活動未見明顯異常，各組當日及總體進食量間比較差異無統計學意義(P>0.05，表6)。

組別n第1天第3天第7天第10天第14天給藥組2057.600±0.14161.500±4.10157.360±10.09758.840±11.22958.100±10.663對照組2062.450±4.03160.425±1.23756.245±7.84057.030±8.10356.640±7.976

(5)大體解剖結果：各組小鼠在實驗期間一般情況良好，未出現明顯毒性不良反應及死亡。實驗結束后對正常存活的小鼠進行大體解剖，肉眼可見心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟顏色、大小、形態均正常，未見大體外觀改變。

(6)最大耐受量計算結果：糖心平膠囊給藥小鼠24h內灌胃3次，每日最大給藥量可達到21.6g/kg，相當于成人每日推薦用藥劑量的360倍，未發現藥物引起的明顯毒性不良反應及死亡。

討 論

糖尿病心臟病是獨立于高血壓、脂代謝紊亂、冠心病等外由慢性血糖升高所引起的心臟病變，占據了糖尿病患者死亡的主要原因[1]。研究發現，早在糖尿病確診以前輕度的血管并發癥就可能已經出現，甚至空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)每升高1mmol/L就會使出現遠期心血管事件的危險性增加17%[2,3]。此外，無論既往是否有過心血管事件，高血糖的持續存在都會增加心血管事件的風險，并且使已經存在的心血管病變進一步發展[4]。因此，早期診斷、及時干預、合理控制血糖對于糖尿病心臟病的治療十分關鍵。

目前在糖尿病心臟病的治療方面，主要通過控制血糖，調節心肌細胞能量代謝，改善脂代謝紊亂，保護心肌細胞功能等方面發揮協同效應，尚無針對性用藥，對于心功能的改善與保護仍需更多的探索[5]。中醫藥以其多靶點，整體治療的特性，結合中醫學對糖尿病心臟病的病因及病機認識，或可成為治療糖尿病心臟病的有效途徑之一[6]。

糖心平膠囊為首都名醫林蘭教授根據其臨床經驗研制，用于改善和治療糖尿病心臟病的中成藥，其主要成分為黃芪、太子參、水蛭、五味子、香加皮等，具有益氣養陰、活血化瘀的作用。林蘭教授認為，糖尿病心臟病隸屬于“胸痹”的范疇，為消渴病日久，心臟氣陰兩虛，血脈瘀阻所致，其病程較長，虛實夾雜[8]。前期臨床研究證實，TXPC具有調節血糖、血脂、改善血液流變、增加心肌營養的作用[8,9]。前期動物實驗研究表明，TXPC能降低實驗動物的ANP、血管緊張素Ⅰ、Ⅱ水平,下調AT1RmRNA的表達,同時降低心肌組織中糖基化終產物特異性受體(receptor of advanced glycation end productions, RAGE)的表達水平，減少糖基化終產物沉積對糖尿病大鼠心肌組織的損傷, 通過多種途徑減輕心肌病變，抗心肌纖維化，抑制和延緩糖尿病心臟病的發生與發展[10,11]。

本研究通過進行TXPC的藥效研究，發現其具有良好的調節糖脂代謝、抗血栓、保護心臟的作用，為進一步探索其應用及機制研究提供了方向。急性毒性實驗中在最大給藥量下，給藥組小鼠未出現死亡，也未見到明顯的毒性不良反應，給藥組小鼠在給藥后出現短暫的倦怠和俯臥不動但2h后緩解，考慮可能與灌胃所造成的機械刺激，同時中藥藥粉在溶解后具有一定的異常氣味有關，可能會引起小鼠短暫的胃腸不適，由于該情況可自行緩解，并且并未造成其體質量、進食量及臟器的顯著性異常，不考慮為毒性不良反應。本研究中TXPC小鼠灌胃的最大耐受量可達到成人每日推薦用藥劑量的360倍，說明了其毒性不良反應較小，臨床用藥相對安全。