IRE1α-JNK通路對早期非酒精性脂肪性肝病作用研究

吳鵬波 王希君 吳曉曼 陳紅光 譚詩云 夏洪淼

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD) 是一種無過量飲酒史，由各種致病因素導致肝臟以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征。目前認為內質網應激、炎性反應、細胞凋亡、自噬水平紊亂等多種因素參與NAFLD發展[1～3]。

近年來研究發現，內質網應激通過未折疊蛋白反應參與NAFLD發生、發展[4]。肌醇依賴酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)是一種內質網跨膜蛋白，作為細胞未折疊蛋白反應重要傳感器，在NAFLD 疾病進程中發揮著至關重要的作用[4]。活化的IRE1α通過多條信號通路促進異常蛋白質的降解、保證新生蛋白質正確折疊。近年來研究發現，IRE1α-JNK信號通路是調控細胞內質網應激后細胞命運轉歸的關鍵環節[5]。不同NAFLD中細胞內質網應激強度不同，不同強度的內質網應激對細胞命運轉歸影響不同[4]。因此本研究探討IRE1α-JNK通路對早期非酒精性脂肪肝病小鼠模型影響。

材料與方法

1.材料:(1)試劑：高脂飼料自制(高糖高脂飼料組成: 基礎飼料66.5%，蔗糖 10%，豬油20%，膽固醇3.4%，膽酸鈉0.1%)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)均購自南京建成生物工程有限公司；IRE1α、JNK、p-JNK、Bcl-2、caspase-3、Bax、LC3、Beclin-1一抗購自美國Sigma公司；二抗購自武漢三鷹生物有限公司；(2) 動物：SPF級健康雄性C57/BL6小鼠由購自武漢大學動物中心，小鼠6～8周齡，體質量20～25g，實驗動物飼養于SPF動物房，室溫20～24℃，相對濕度約40%～60%。(3)主要儀器：石蠟切片機(日本Olympus公司), 普通光學顯微鏡(日本Olympus公司),電泳系統(美國Bio-Rad公司),透射電子顯微鏡(日本Olympus公司)。

2.動物分組及干預：將C57/BL6小鼠隨機分為對照組、高脂飲食組、IRE1α-shRNA組、慢病毒空白載體組，每組5只；在造模前IRE1α-shRNA組，慢病毒空白載體組小鼠給予腹部肝區注射IRE1α-shRNA慢病毒載體及慢病毒空白載體100微升/次，連續3天，適應性飼養2天后進行后續實驗。對照組給予正常飲食，其余組高糖高脂飲食誘導NAFLD，飼養3周。

3.HE 染色：實驗結束后處死小鼠獲取肝組織組織放入10%甲醛溶液中固定72h，石蠟包埋，切片機切4μm厚切片，經過脫蠟、脫水、蘇木精染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色，再經過梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在倒置顯微鏡下觀察肝組織病變。

4.肝功能及炎性水平檢測：處死小鼠后提心獲取各組小鼠血清，南京建成生物有限公司試劑盒檢測各組小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β水平。

5.電鏡觀察肝組織自噬結構：處死小鼠后獲取肝組織，迅速獲取大小約1mm3肝組織用預冷的4%戊二醛固定，經過PBS充分漂洗后1%餓酸固定，經過乙醇及丙酮處理脫水后包埋，采取醋酸鈾-硝酸鉛雙重染色，最后透射電鏡觀察肝組織內自噬相關結構。

6.Western blot法檢測蛋白表達：處死小鼠后獲取新鮮的肝組織，碾磨并用裂解液裂解，水煮法制作蛋白樣品。蛋白樣品經過SDS-PAGE分離膠中電泳、轉膜、切膜，加入相應的一抗孵育過夜，次日早晨加入二抗后孵育2h，顯影定影檢測各目標相對表達。

結 果

1.IRE1α-JNK通路變化：與對照組比較,高脂飲食組肝組織中IRE1α表達增加，高脂飲食組與空白載體組肝組織中IRE1α表達比較，差異無統計學意義；與模型組比較，IRE1α-shRNA組肝組織中IRE1α表達明顯降低。與對照組比較,高脂飲食組肝組織中p-JNK表達增加，高脂飲食組與空白載體組肝組織中p-JNK表達比較，差異無統計學意義；與空白載體組比較，IRE1α-shRNA組肝組織中p-JNK表達明顯降低。結果提示在造模過程中IRE1α-JNK通路激活，而IRE1α-shRNA慢病毒載體注射可以抑制IRE1α-JNK通路，詳見圖1。

圖1 Western blot法檢測IRE1α-JNK通路變化a.對照組；b.模型組；c.空白載體組；d.IRE1α-shRNA組

2.肝功能及炎性水平：與對照組小鼠比較，模型組小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β明顯升高(P均<0.05)；與空白載體組小鼠比較，IRE1α-shRNA組小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β明顯升高(P均<0.05)，空白載體組與模型組小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β比較，差異無統計學意義(P均>0.05)，詳見圖2。

圖2 各組小鼠肝功能及炎性水平a.對照組;b.模型組;c.空白載體組;d.IRE1α-shRNA組;與對照組比較，*P<0.01;與空白載體組比較， #P<0.05,##P<0.01

3.肝組織病理染色結果：對照組小鼠肝組織肝小葉結果正常，細胞無明顯脂肪變性，無炎癥及壞死；模型組和空白載體組可見肝小葉結構尚整齊，可見少量細胞脂肪變性，少許炎性細胞，未見明顯的細胞壞死；與空白載體組比較，IRE1α-shRNA組肝臟組織可見肝小葉輕度紊亂，大量炎性細胞，肝細胞脂肪變性明顯，詳見圖3。

圖3 各組小鼠肝組織的病理學改變(HE,×200)A.對照組；B.模型組；C.空白載體組；D.IRE1α-shRNA組

4.電鏡觀察自噬結構：對照組肝細胞形態正常，偶見自噬小體或自噬溶酶體出現；模型組和空白載體組肝細胞出現輕度腫脹，線粒體輕中度空泡化，少許嵴消失，與正常對照組比較，肝細胞內自噬小體或自噬溶酶體增加；IRE1α-shRNA組肝細胞中度腫脹，線粒體上述病變加重，肝細胞中鮮見自噬小體或自噬溶酶體結構,詳見圖4。

圖4 透射電鏡觀察小鼠肝細胞超微結構(×12000)A.對照組;B.模型組;C.空白載體組;D.IRE1α-shRNA組

5.凋亡及自噬相關蛋白表達:與對照組比較, 模型組和空白載體組肝組織內Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白無明顯變化，而Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ均明顯增加,P62明顯降低，模型組和空白載體組上述蛋白表達比較，差異無統計學意義；與空白載體組比較，IRE1α-shRNA組肝組織Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達明顯減少，而Bax、P62、caspase-3表達明顯增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)，詳見圖5。

圖5 Western blot法檢測凋亡及自噬相關蛋白表達a.對照組；b.模型組；c.空白載體組；d.IRE1α-shRNA組

討 論

目前國內學者認為內質網應激在NAFLD發展中扮演著重要的角色[6,7]。內質網通過激活未折疊蛋白質反應以保護由內質網應激所引起的細胞損傷，恢復細胞穩態。近年來發現不同程度的內質網應激對NAFLD發揮不同的作用[4]。在NAFLD早期，短暫(輕度)的內質網應激雖然直接誘導細胞凋亡，內質網應激可通過啟動自噬等保護機制對抗凋亡，最終細胞即使承受內質網應激刺激，凋亡不會出現明顯增加;而NAFLD晚期，長期(重度)的內質網應激可通過一方面可直接誘導細胞凋亡，另一方面內質網直接損傷細胞保護機制直接導致細胞凋亡率明顯增加。IRE1及其介導的內質網應激——非折疊蛋白反應因被發現參與細胞應激后細胞存亡抉擇而引起廣泛的關注[8]。本研究發現通過注射IRE1α-shRNA慢病毒載體沉默IRE1α-JNK通路發現肝臟脂肪變性加重，組織中炎性細胞明顯增加,血清炎性介質明顯升高，提示IRE1α-JNK通路對NAFLD具有保護作用。而既往研究提示IRE1α-JNK在NAFLD中扮演有害角色，本研究結果與既往研究相矛盾[9]。

既往研究NAFLD時，動物模型制作多高脂飲食8周甚至以上[9～11]，而在本研究中動物僅高脂飲食3周。本研究反映IRE1α-JNK對早期NAFLD的作用，而既往的研究是IRE1α-JNK對晚期NAFLD的作用。故本研究與既往研究結果矛盾可能原因在于早晚期NAFLD中內質網應激程度不同，在NAFLD早期，適度的內質網應激通過IRE1α-JNK通路通過促進自噬抵抗細胞凋亡扮演有利的角色。凋亡和自噬作為一種維持機體自身穩定的基本生理機制,它們分別通過清除損傷、衰老與突變的細胞和降解錯誤折疊的蛋白質等途徑來維持自身的穩態和各種器官及系統的正常功能[12～17]。內質網應激可通過調控自噬和細胞凋亡參與NAFLD發生、發展[13]。本研究發現早期NAFLD中IRE1α-JNK通路激活后自噬水平增高，凋亡無明顯增加；抑制IRE1α-JNK通路后自噬水平降低，凋亡明顯增加。

綜上所述，IRE1α-JNK通路可能通過促進自噬對早期NAFLD起保護作用，然而IRE1α-JNK通路信號如何通路調控自噬有待于進一步探索。明確IRE1α-JNK通路在NAFLD中自噬調控的具體作用機制，將有利揭示自噬NAFLD中鮮為人知的一面，為NAFLD臨床治療及預防提供新的思路。