一株產香假絲酵母的篩選及其特征代謝風味物質分析

張建敏，楊康卓，劉 芳，何張蘭，彭志云，鄭 佳，喬宗偉，趙 東

(宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007)

濃香型白酒窖內發酵過程是一種多菌種參與的多邊反應過程。來自曲藥、窖泥及發酵環境的多種微生物（細菌、酵母和霉菌）以酒醅為載體，在白酒窖內發酵過程中進行復雜的物質能量代謝，生成各類代謝產物和風味物質。獨特的固態多微釀造工藝賦予了白酒豐富的呈香呈味物質和健康活性功能成分[1-4]。近年來，對白酒微量成分研究結果表明，風味成分的種類和含量都遠遠超過健康活性功能成分。已有報道中，在濃香型白酒中檢出了大量的呋喃類物質（抗氧化、抗癌活性）、苯并呋喃類化合物（抗炎性）、糠醛（殺菌）等[4]，濃香型大曲中檢出了吡嗪類（抗氧化、抗癌）、萜烯類（抗癌、抗病毒、抗炎）等[5]。而微生物代謝產生萜烯等健康活性功能成分少有文獻報道。

因此，本研究試圖從濃香型白酒發酵酒醅中篩選出1 株具有特殊功能的酵母菌，并結合形態學和26S rDNA 測序分析鑒定、頂空固相微萃取-氣質聯用技術（HS-SPME-GC/MS）分析其菌體及代謝特征，以提高對酵母在發酵過程中的科學認識。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 培養基

種子培養基、增殖培養基：YPD 培養基，購自青島海博生物技術有限公司。

發酵培養基：五糧粉糖化液制備參考文獻[6]。

1.1.2 主要試劑與儀器

Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒SK8259(上海生工生物)；SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒SK8131(上海生工生物)；立式高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS）購自上海博訊實業有限公司；生物安全柜（ESCO Class II），珠海市珠峰儀器儀表有限公司；固相微萃取手柄和50 μm CAR/DVB/PDMS 纖維萃取頭，美國Supelco 公司；氣質聯用儀（7890B GC-5977B MSD）美國Agilent 公司；4-辛醇，GC級，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株鑒定

1.2.1.1 形態觀察試驗

對平板劃線的單菌落進行形態觀察以及顯微形態觀察。

1.2.1.2 分子生物學鑒定

4)浙江省觀光采摘節慶在市級空間上具有數量上和質量上的差異。寧波是各市的典范，金華和臺州數量和質量也實現了協調發展，杭州、嘉興、湖州質量上都要增強從而跟上數量的發展，溫州和紹興應多開發觀光采摘節慶，衢州和舟山在數量和質量上都有待提高。

DNA 提?。簩⒕?-13 接入增殖培養基中，30 ℃培養7 d，取1 mL菌液10000 r/min離心5 min，棄上清液，收集菌體，按生工生物真菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8259)提取DNA，-20 ℃保藏備用。

PCR 擴增：利用引物NL1 和NL4 對酵母菌基因組26S rDNA D1/D2 進行擴增，NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG，NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG。擴增體系(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L each) 1 μL，DNA 10 ng，引物F(10 μmol/L)0.5 μL，引物R(10 μmol/L)0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。擴增程序：94 ℃4 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃60 s，共30 個循環；72 ℃10 min，4 ℃終止反應。

26S rDNA 序列測定：利用膠回收試劑盒進行PCR 擴增產物的純化；純化產物的測序工作由上海生工生物有限公司完成。

系統發育樹構建[7-8]：將所測定的酵母菌26S rDNA 基因序列分別與GenBank 數據庫進行BLAST 分析，選取與實驗菌株親緣關系相對較近的標準菌株用Clustalw 軟件進行序列比對，采用MEGA 5 軟件進行系統發育分析，構建系統發育樹。

1.2.2 頂空固相微萃取-氣質聯用技術分析發酵液風味

1.2.2.1 菌株發酵液培養

將酵母菌株3-13 種子液接種于五糧粉液體培養基中30 ℃靜置培養7 d。

萃取頭的老化：各類型萃取頭在首次使用前均需要在熱條件下老化，老化程序參考Supelco 老化指南。

萃取條件：吸取適量發酵液于10000 r/min離心5 min，吸取過0.45 μm 膜的上清液1 mL 加入頂空瓶中，加入50 μL 4-辛醇（10 mg/L）作為內標，置于60 ℃加熱振蕩器中平衡15 min，萃取頭吸附揮發性香氣成分45 min，隨后插入GC 進樣口熱解析3 min，分析其中揮發性成分。

1.2.2.3 GC/MS分析條件

GC 條件：DB-Wax（30.0 m 長×0.25 mm 內徑×0.25 μm 膜厚，J&W，美國）毛細管色譜柱；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，載氣He 流速1 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持15 min。

MS 條件：EI 源，電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃，四級桿溫度150 ℃，質量數掃描范圍35～350 amu。

1.2.2.4 化合物鑒定與半定量分析

化合物鑒定采用參考文獻[9]所屬方法進行化合物定性；單個化合物的相對含量采用其與內標響應值的比進行半定量分析，含量以mg/L表示。

2 結果與討論

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態觀察試驗

經觀察，菌株3-13 菌落呈蠟狀圓形，柔軟、光滑、濕潤，平板散發有濃厚的酒精發酵氣味；顯微形態呈球形、橢圓形，大小為0.5～1.5 μm，出芽生殖。見圖1。

圖1 3-13菌落形態及顯微形態

2.1.2 分子生物學鑒定

將菌株26S rDNA 序列與GenBank 上的其他26S rDNA 序列進行Blast 分析，做進化樹(圖2)比較結果顯示，菌株3-13 與Candida pseudohumilisAS 2.3956（FJ888526.1）相似性為99 %，將該菌鑒定為Candida pseudohumilis。

2.2 菌株3-13發酵液揮發性成分分析

本研究利用HS-SPME法提取發酵液中的香氣成分，發酵液和空白對照組的色譜圖差異較明顯（圖3）。

圖2 3-13菌株系統發育樹

圖3 菌株3-13主要物質總離子流圖

如表1 所示，在菌株發酵液中共鑒定并定量了20 種揮發性成分，其中酯類6 種、萜烯類4 種、芳香族類4 種、醛酮類2 種、醇類2 種、酸類1 種，總含量比例為芳香族類62.61 %、醇類27.52 %、酯類4.36 %、萜烯類2.79 %、酸類2.57 %、醛酮類0.17%。

芳香族類：苯乙醇（69.56 %）、苯酚（0.27 %）、苯甲醛（0.51 %）、2-苯乙酰酯（29.68 %）。芳香族化合物大多數具有典型的花香和甜香味，其中苯乙醇被認為是優質濃香型白酒的主要香味成分之一；酚類物質具有特殊氣味，其中苯酚在低濃度時表現為墨水氣味，也為白酒中重要的呈香呈味成分。

表1 揮發性成分含量及香氣特征

醇類：異戊醇（99.49 %）、3-甲硫基-1-丙醇（0.50%）。異戊醇是白酒中主要的醇類物質，低濃度時具有典型的青草氣味。

酯類：己酸乙酯（51.58 %）、庚酸乙酯（6.30%）、辛酸乙酯（13.45%）、壬酸乙酯（7.84%）、癸酸乙酯（16.46 %）、棕櫚酸乙酯（4.36 %）均為直鏈飽和酯，呈現水果味，且大部分在濃香型白酒中已經被檢出，其中己酸乙酯含量在總酯中比例為51.58%。己酸乙酯是濃香型白酒的主體呈香呈味物質[1]，且該菌株產己酸乙酯，可以用于制造功能酵母強化曲提高濃香型白酒原酒中己酸乙酯含量。

萜烯類：芳樟醇（13.61 %）、β-金合歡烯（7.87 % ）、γ-壬內酯（4.99 % ）、橙花叔醇（73.60 %）。萜烯類化合物廣泛存在于植物中，以異戊二烯為結構單位倍數的烴類及其含氧衍生物，包括單萜烯類、倍半萜烯類以及二萜烯類化合物等。中藥材含有大量的萜烯類化合物，這類化合物具有抗癌性、抗病毒以及抗炎癥等活性[4]。在酒體中，這些萜烯類化合物不但具有潛在的生物活性成分的功能功效，而且還具有呈香呈味的作用。萜烯類化合物是我國白酒研究中新發現的一類化合物，在藥香型、濃香型、醬香型白酒中均有檢出[4]。而濃香型白酒中萜烯類化合物的來源于原料、曲藥等，而由菌株發酵產生萜烯類化合物少有報道，該菌株所產橙花叔醇含量占萜烯類量的73.60 %，具有一定的研究應用價值。

醛酮類：壬醛（53.76%）、乙偶姻（47.42%），其中乙偶姻為白酒中健康因子四甲基吡嗪的前體物質[4]，四甲基吡嗪是從川芎中分離出來的一種活性成分，具有增加腦血管的血流量等功效。該菌株能代謝產生乙偶姻，對提高濃香型基酒中四甲基吡嗪的含量具有一定的積極作用。

3 結論

本研究從五糧液發酵酒醅中篩選出1 株產香酵母3-13，經形態學和26S rDNA 測序分析鑒定該菌株為Candida pseudohumilis。利用HS-SPMEGC/MS 分析其于五糧粉液體培養基中的代謝風味物質，該菌株不僅代謝出濃香型酒主體香味成分己酸乙酯且同時代謝橙花叔醇、芳樟醇、金合歡烯等萜烯類健康活性功能成分。這對濃香型白酒強化發酵代謝健康活性功能成分、提高白酒健康價值、酵母強化制曲提高濃香型白酒原酒中己酸乙酯含量提供一種新的菌株，也對假絲酵母在發酵過程中的作用有了新的認識。