芍藥提取物對高脂誘導大鼠認知功能的影響

朱殿明 葛家宏 楊俊杰

摘要 目的：探討芍藥提取物對高脂誘導的大鼠認知功能的影響及機制，為臨床改善精神分裂癥認知功能障礙提供新的思路和線索。方法：選取40只雄性SD大鼠，均給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、二甲雙胍組、芍藥提取物實驗組各10只，分別灌胃生理鹽水、0.15 g/kg二甲雙胍溶液，5 mg/mL芍藥提取物。給藥結(jié)束后檢測大鼠體質(zhì)量，性腺脂肪量，血糖和糖化血紅蛋白，Morris水迷宮系統(tǒng)測定各組大鼠認知功能，蛋白免疫印跡實驗檢測PI3K、AKT蛋白表達水平。結(jié)果：與模型對照組比較，二甲雙胍組、芍藥提取物實驗組大鼠體質(zhì)量，體質(zhì)量，性腺脂肪量，血糖和糖化血紅蛋白均降低（P<0.05）;大鼠的逃避潛伏期、探索距離顯著減少，目標象限游泳時間顯著增長、站臺穿越次數(shù)顯著增加;大鼠海馬組織中PI3K、phospho-AKT（S473）蛋白的表達水平降低。結(jié)論：芍藥提取物可降低高脂誘導的大鼠的體質(zhì)量和血糖水平，改善認知功能，其機制與抑制PI3K/AKT信號通路相關(guān)。芍藥提取物可能成為治療精神分裂癥認知功能障礙的新方法。

關(guān)鍵詞 芍藥提取物;精神分裂癥;認知功能;代謝綜合征;PI3K/AKT信號通路

Abstract Objective：To investigate the effect and mechanism of paeonia lactiflora extract on the cognitive function of high-fat diet induced rats so as to provide new ideas for clinical treatment of cognitive dysfunction in schizophrenia. Methods：A total of 40 male SD rats were feed with high-fat and high-glucose diet， and they were divided into a blank control group， a model control group， a metformin group， a paeonia lactiflora extract group with 10 cases in each group. The 10 rats were respectively orally given with normal saline， 0.15 g/kg metformin solution， 5 mg/mL paeonia lactiflora extract. After the administration， the rats′ body weight， gonadal fat mass， blood glucose and glycosylated hemoglobin were measured. The Morris water maze system was used to measure the cognitive function of rats in each group， and the protein expression levels of PI3K and AKT were measured by Western blotting. Results：Compared with the model control group， the weight， body weight， gonadal fat mass， blood sugar and glycosylated hemoglobin of rats in the metformin group and the peony extract experimental group were reduced （P<0.05）; the escape latency and exploration distance of rats were significantly reduced， and the target quadrant swimming time increased significantly and the number of platform crossings increased significantly; the expression levels of PI3K and phospho-AKT （S473） proteins in the hippocampus of rats decreased. Conclusion：Paeonia lactiflora extract can reduce the body weight and blood glucose levels in high-fat diet induced rats， and improve their cognitive function. The mechanism is related to the inhibition of the PI3K/AKT signaling pathway. Paeonia lactiflora extract may be a new way for the treatment of cognitive dysfunction in schizophrenia.

Keywords Paeonia lactiflora extract; Schizophrenia; Cognitive function; Metabolic syndrome; PI3K/AKT signaling pathway

中圖分類號：R277.7;R285.5;R749.1 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.009

精神分裂癥為高復發(fā)，高致殘的重性精神疾病，其終身患病率約為1%，患者易造成極大的疾病負擔[1]。隨著抗精神病藥物的發(fā)展，精神分裂癥的陽性癥狀已取得較好的療效，但是認知功能障礙一直是治療中的難題?？咕癫∷幬锊粌H對改善認知功能效果有局限性，而且藥物引致的代謝紊亂可能會進一步加重認知障礙[2]。然而認知功能卻是影響患者回歸社會，改善疾病預后的重要因素之一。有研究報道，當歸芍藥散中的芍藥提取物，不僅能改善阿爾茨海默氏癥以及腦卒中大鼠認知功能的作用[3]，而且在代謝方面具有降壓、增強糖尿病大鼠對胰島素的敏感性、抑制脂質(zhì)過氧化及保護肝細胞等作用[4]。預示芍藥提取物有望成為改善精神分裂癥患者認知功能障礙的有效治療方式，但目前尚缺乏相關(guān)研究。本研究探討芍藥提取物對高脂誘導的大鼠認知障礙的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 由野生型WKY大鼠基因突變后近交繁衍的SPF級SH大鼠40只，雄性，10周齡，采購于蘇州大學。大鼠同意進行分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度維持室溫（23±2）℃，進行12 h循環(huán)光照周期，飼養(yǎng)期間大鼠能夠自由進行飲水和攝食。該實驗已經(jīng)倫理委員會批準，實驗全程均遵循《實驗動物管理條例》{倫理審批號：JN.No20191215c0600105[347]}。

1.1.2 藥品 芍藥提取物（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，生產(chǎn)批號：050124）;二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，生產(chǎn)批號：20023370）。

1.1.3 試劑與儀器 糖化血紅蛋白試劑盒（南京建成生物有限公司，貨號：A056-1）;BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：P0012）;抗體PI3K（Proteintech，貨號：67121-1-Ig）、AKT（Proteintech，貨號：10176-2-AP）、phospho-AKT（S473）（Proteintech，貨號：66444-1-Ig）、β-actin（Proteintech，貨號：66009-1-Ig）;Morris水迷宮（上海吉量軟件科技有限公司，型號：JLBehv-M）;全波長酶標儀（Bio-RAD，美國，型號：1681130A）;三諾安穩(wěn)血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司，型號：STX）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只SH大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、二甲雙胍組、芍藥提取物實驗組，每組10只，大鼠會進行7 d的適應性喂養(yǎng)。空白對照組喂食普通飼料，其余各組大鼠喂食自制高脂高糖飼料，共喂食8周[5]。

1.2.2 給藥方法 二甲雙胍組灌胃0.15 g/kg二甲雙胍溶液，芍藥提取物實驗組灌胃5 mg/mL芍藥提取物，空白對照組、模型對照組給與等體積生理鹽水，1次/d，所有大鼠均連續(xù)給藥4周。

1.2.3 檢測指標和方法

1.2.3.1 Morris水迷宮實驗 按“1.2.1”的方法進行分組，采用Morris水迷宮法[6]對大鼠的認知功能進行測定：4個標記點分別位于4個象限的正中間處，在任意一象限水中，擺放一個黑色露臺。在上午和下午4個標記點分別訓練一次，共進行4 d。第5天時，去掉黑色露臺，將大鼠從第一個標記點放入水中。Any-maze動物行為學分析軟件將會記錄大鼠的游泳軌跡及90 s內(nèi)尋找平臺的時間（逃避潛伏期，學習功能）;第6天進行空間探索實驗（記憶功能），記錄90 s穿過虛擬平臺的次數(shù)。

1.2.3.2 取材與標本處理 按“1.2.1”的方法進行分組，實驗結(jié)束后，對大鼠禁食12 h，記錄各組大鼠體質(zhì)量和空腹血糖值。各組大鼠尾靜脈取血，提取取血清，按試劑盒說明書測定糖化血紅蛋白[7]。取大鼠性腺脂肪組織，稱重，記錄其重量。

1.2.3.3 蛋白免疫印跡實驗檢測PI3K、AKT蛋白表達水平 取出凍存的大鼠組織使用磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液進行裂解，用均漿器研磨組織至完全粉碎，取上清液，使用BCA蛋白測定試劑盒對組織蛋白濃度進行定量。組織蛋白通過SDS-PAGE膠進行分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。使用5%的脫脂奶粉對非特異性結(jié)合位點進行阻斷，用相應一抗（目標蛋白一抗：PI3K、phospho-AKT（S473）、AKT;內(nèi)參蛋白一抗：β-actin）4 ℃孵育過夜。在室溫下與交聯(lián)二抗孵育2 h。使用ECL化學發(fā)光試劑盒和化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行成像。利用Image J 8.0對蛋白免疫印跡實驗的條帶進行灰度分析。PI3K以β-actin作為參照，Phospho-AKT（S473）以AKT作為參照，以條帶灰度比值作為表達結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，其中計量資料用（±s）表示，組間比較采用單因素方差（One Way ANOVA）分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥提取物對高脂誘導的大鼠模型體質(zhì)量、性腺脂肪量、血糖和糖化血紅蛋白的影響 與空白對照組比較，模型對照組血糖、糖化血紅蛋白水平顯著升高（P<0.05），體質(zhì)量、性腺脂肪含量也顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型對照組比較，二甲雙胍組、芍藥提取物組明顯降低大鼠血糖及糖化血紅蛋白水平（P<0.05），體質(zhì)量、性腺脂肪含量也顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 芍藥提取物對大鼠模型Morris水迷宮定位航行實驗的影響 定位航行實驗，與空白對照組比較，模型對照組逃避潛伏期時間延長、游泳探索距離增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型對照組比較，二甲雙胍組、芍藥提取物組逃避潛伏期時間顯著減短、游泳探索距離顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 芍藥提取物對大鼠模型Morris水迷宮空間探索實驗的影響 空間探索實驗，與空白對照組比較，模型對照組目標象限游泳時間顯著縮短，站臺穿越次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型對照組比較，二甲雙胍組、芍藥提取物組目標象限游泳時間顯著增長，站臺穿越次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

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（2020-09-22收稿 責任編輯：蒼寧）