脂聯素基因單核苷酸多態性與多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗的關系研究

朱艷 周琴 安潔 張劍治 李娟

摘要：目的? 探討脂聯素濃度、脂聯素基因第2外顯子的+45T/G（rs2241766）和第2內含子的+276G/T（rs1501299）兩個多態性位點、PCOS伴胰島素抵抗（IR）三者的關系，并探討其是否可以為臨床診療及預后提供數據依據。方法? 收集2017年1月～2019年1月昆山市中醫醫院就診年齡在20～35歲，符合鹿特丹標準的PCOS患者和正常人各100例。采用分子生物學的方法對脂聯素基因進行分型。比較兩組臨床資料、脂聯素濃度及脂聯素基因分型。結果? PCOS組的雄激素、雌激素、促黃體生成素、胰島素、膽固醇、甘油三酯、血糖高于對照組（P<0.05）;對照組的促卵泡生成素、泌乳素低于 PCOS 組（P<0.05）;PCOS組脂聯素水平和IR存在線性關系（P<0.05）;對照組脂聯素基因多態位點+276G/T（ rs1501299）不符合 HWE 遺傳定律，組間無法比較;兩組+45T/G（rs2241766）位點的基因型（TT、TG、GG）頻率分布比較，差異無統計學意義（P>0.05），此位點基因型頻率與脂聯素濃度、HOMA-IR進行關聯分析，差異無統計學意義（P>0.05）。結論? PCOS 組的脂聯素水平和IR呈負相關，脂聯素基因+45T/G（rs2241766）位點基因分型與PCOS伴IR患者無顯著關系，可能不參與 PCOS 發生。

關鍵詞：多囊卵巢綜合征;胰島素抵抗;脂聯素濃度;脂聯素基因多態性;+276G/T（rs1501299）;+45T/G（rs2241766）

中圖分類號：R711.75? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.22.025

文章編號：1006-1959（2020）22-0087-05

Study on the Relationship Between Adiponectin Gene Single Nucleotide Polymorphism

and Polycystic Ovary Syndrome with Insulin Resistance

ZHU Yan，ZHOU Qin，AN Jie，ZHANG Jian-zhi，LI Juan

（Department of Gynecology，Kunshan Traditional Chinese Medicine Hospital，Kunshan 215300，Jiangsu，China）

Abstract：Objective? To investigate the adiponectin concentration， the +45T/G （rs2241766） and +276G/T （rs1501299） polymorphisms in the second exon of the adiponectin gene， and PCOS with insulin resistance （IR） The relationship between the three and explore whether it can provide data for clinical diagnosis and treatment and prognosis.Methods? From January 2017 to January 2019， 100 PCOS patients and 100 normal people who were 20-35 years old and met the Rotterdam standard were collected from Kunshan Traditional Chinese Medicine Hospital. Adiponectin genes were typed using molecular biology methods. The clinical data， adiponectin concentration and genotype of adiponectin were compared between the two groups. Results? Androgen， estrogen， luteinizing hormone， insulin， cholesterol， triglyceride， and blood sugar in the PCOS group were higher than those in the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）; the control group had low follicle stimulating hormone and prolactin the PCOS group， the difference was statistically significant （P<0.05）; there was a linear relationship between adiponectin levels and IR in the PCOS group （P<0.05）; Adiponectin gene polymorphic site +276G/T （rs1501299） in the control group does not comply with the HWE genetic law and cannot be compared between groups; the frequency of genotypes （TT， TG， GG） at +45T/G （rs2241766） sites in the two groups the distribution comparison showed no statistically significant difference （P>0.05）. The correlation analysis between the genotype frequency of this locus and the adiponectin concentration and HOMA-IR showed that the difference was not statistically significant （P>0.05）.Conclusion? The level of adiponectin in the PCOS group is negatively correlated with IR. The genotyping of adiponectin gene +45T/G （rs2241766） has no significant relationship with patients with PCOS with IR， and may not be involved in the occurrence of PCOS.

Key words：Polycystic ovary syndrome;Insulin resistance;Adiponectin concentration;Adiponectin gene polymorphism;+276G/T （rs1501299）;+45T/G （rs2241766）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種多基因遺傳、臨床異質性、不可治愈性、進展性發展的內分泌功能紊亂性疾病，具有較高的發病率，據近期流調學統計全球發病率為5%～15%，而在我國漢族育齡期女性中的發病率為5.6%，占排卵障礙性不孕癥的30%～60%，甚至更高，亟待解決[1]。PCOS目前仍病因不清，且缺乏有效的治療手段，尚無法達到完全恢復下丘腦-垂體-卵巢軸的平衡性，臨床也常見子宮內膜病變、心理病變、乳腺疾病、代謝綜合征等[2]，嚴重影響了女性的身心健康。研究表明，脂肪組織可分泌出多種細胞因子來參與機體內分泌代謝及免疫等活動。脂聯素（APN）作為脂肪細胞分泌的主要的能量調節因子之一，與胰島素敏感性、葡萄糖攝取和脂質代謝密切相關[3]。亦有研究證實了血清脂聯素與PCOS胰島素敏感性兩者間有較強關聯性，認為脂聯素不僅參與PCOS胰島素抵抗（IR）的發生和發展過程，同時也與PCOS的發病有關。但部分研究者持相反態度[4]，認為脂聯素與PCOS沒有明顯的相互關系。近年來，脂聯素基因（ADIPOQ）與 PCOS相關性的研究也成為國內外學者關注的熱點。目前研究已發現的ADIPOQ單核苷酸多態性（SNP）位點就有近30個，大多集中在第2外顯子的rs2241766和第2內含子的rs1501299兩個多態性位點上。研究發現[5-7]，這2個多態性位點與肥胖、心血管疾病、IR和2型糖尿病密切相關。但是目前為止，這兩個多態性位點與PCOS相關性的研究結果尚有爭議。本研究通過分析 ADIPOQ 的上述2個多態性位點在PCOS患者與對照組之間基因型及等位基因頻率分布的差異，及脂聯素濃度與PCOS間的關系，來研究其是否與PCOS發病存在相關性，以期為PCOS的病因探索提供數據依據。

1資料與方法

1.1一般資料? 經昆山市中醫醫院倫理委員會審查同意，收集2017年1月～2019年1月昆山市中醫醫院就診年齡在20～35歲，BMI在19～24（kg/m2），排除標準：①近3個月內使用抗生素、糖皮質激素、避孕藥、促排藥、抗糖尿病藥、降壓藥、精神類藥等藥物史;②近期任何手術史;③有胃腸道疾病、活動性感染、吸煙酗酒者。符合疾病診斷標準的PCOS患者100例，健康人群100例作為對照組，研究對象均知情同意。

1.2診斷標準? 選用歐洲人類生殖和胚胎學研究中心和美國生殖醫學會（ESHRE/ASRM）2003年1月頒布的鹿特丹標準作為病例診斷標準。排除以下疾病：如卵巢或腎上腺分泌雄激素腫瘤、高催乳素血癥、低促性腺激素低性腺激素性閉經、柯興氏綜合征（cushing）、遲發性先天性腎上腺皮質增生、甲狀腺功能異常。臨床至少需符合下述3條標準的其中2條：①很少排卵或不排卵;②高雄激素的臨床和（或）生化表現（臨床如：多毛、痤瘡、男性型脫發，生化：高水平的血清睪酮（T）或游離T，或自由雄激素指數（FAI）或硫酸脫氫表雄酮（DHEAS）升高;③超聲下的改變：任何一側卵巢的直徑在29 mm，存在≥12個卵泡，或（和）卵巢的體積>10 ml。

1.3方法

1.3.1臨床指標? 性激素、空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS），計算HOMA-IR水平[HOMA-IR=FINS（mU/L）×FBG（mmol/L）/22.5]、甘油三酯，膽固醇、脂聯素濃度。于月經正常來潮或閉經患者于孕酮撤退性出血月經周期的第3天上午（9～10時）空腹并靜坐約15 min后再抽取肘靜脈血。并用含有EDTA的抗凝管收集5 ml靜脈血。取1 ml保存到EP管-80 ℃保存。將剩余的血液放入離心機中4 ℃，1500 rpm，離心10 min，收集管中上部分黃色血清放到-80 ℃保存。

1.3.2脂聯素基因分型檢測? 采取經典酚-氯仿經典方法提取外周血基因組DNA（基因組 DNA 提取試劑盒選自上海生工）。根據脂聯素基因的核苷酸序列設計各個位點的擴增引物使用PCR擴增目的基因片段。PCR擴增引物序列見表1，PCR反應體系（25 μl） 包含100 ng提取DNA，1.0 UTaq酶，2 μl上游以及下游引物2×PCR buffer。PCR反應條件：95 ℃變性6 min，94 ℃ 30 s，60℃ 30 s，72 ℃45 s 30個循環，最后72 ℃延伸10 min。限制性內切酶酶SmaI和BsmI酶切（Themo，美國）。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，加入3μl GelRed 核酸染料，電泳結束后，打開凝膠顯影儀，觀察并記錄結果。

1.4統計學方法? 本研究資料采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。運用Shapiro-Wilk test結合正態圖檢驗所分析數據的正態性。基因多態性位點進行 HEW 遺傳平衡檢驗。按照定律所述，通過各種基因型的頻率計算等位基因的頻率，由等位基因的頻率計算出期望頻率值。將實際頻率值和期望頻率值進行？字2檢驗，如果P>0.05，那么觀望值符合預期值，結果符合HWE定律;如果P<0.05，則觀望值不符合預期值，結果不符合HWE定律。符合正態分布的計量資料以（x±s）表示，兩組樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗，配對樣本均數比較采用配對t檢驗，偏態分布的計量資料以中位數和四分位數 M（Q25，Q75）表示，采用兩獨立樣本的秩和檢驗，多組比較采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組一般資料比較? PCOS組雄激素、雌激素、促黃體生成素、促卵泡生成激素、泌乳素、胰島素、膽固醇、甘油三酯、血糖、HOMA-IR高于對照組，脂聯素低于對照組，PCOS組初潮月經紊亂發生率高于對照組（P<0.05）;兩組年齡、BMI、如飲酒、教育情況、體力勞動情況比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。