特異性脫敏法治療柳樹花粉引起的過敏性鼻炎的實驗研究?

羅兆莉 軒 冉 莘琳琳 孫其玉 董晏榕 任其奎 楊 帆 田兆菊

(1.山東第一醫科大學/山東省醫學科學院 公共衛生學院,泰安 271016)(2.山東第一醫科大學/山東省醫學科學院 第二附屬醫院,泰安 271016)

花粉是引起I型超敏反應性疾病的重要致敏原之一,致敏花粉的種類因地區、海拔、季節的不同而有所不同[1]。柳樹是我國分布較廣的樹種,每年產生的花粉已成為春季主要的致敏原之一,常引起人類過敏性鼻炎的發作。目前,臨床上多采用口服抗組胺類藥物、同時鼻噴激素法治療過敏性鼻炎,有一定療效;但患者長期使用會引發神經系統的不良反應,

表現為頭暈、頭昏、嗜睡、乏力等[2]。特異性脫敏療法是目前唯一能因病治療過敏性疾病的方法[3],該方法可預防新出現的過敏原引起的超敏反應,防止過敏性鼻炎進一步發展為哮喘。

目前,我國臨床成功應用的第一種特異性脫敏治療制劑是塵螨滴劑,對其他過敏原引起的過敏性鼻炎的免疫治療還處于研究階段。為此,本研究建立了柳樹花粉過敏性鼻炎的小鼠模型,采用遞增變應原劑量的方法給小鼠注射花粉過敏原,通過比較小鼠鼻部癥狀、檢查鼻黏膜組織形態學以及血清中sIgE的含量變化[4],探索特異性脫敏療法對過敏性鼻炎的治療效果,為臨床防治過敏性鼻炎提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級健康昆明小鼠58只,雄雌隨機,7周齡,體質量(18±2)g,由山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)實驗動物中心提供。植物蛋白提取試劑盒(Cat#BC3720)為北京索萊寶科技有限公司產品;小鼠血清特異性sIgE酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒為上海廣銳生物科技有限公司產品;B-500超微量分光光度計為上海元析儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 柳樹花粉的采集及形態觀察:于2018年3月柳樹雄花成熟散粉時,采用自然脫落法收集花粉[5],室溫晾干后裝于1.5 mL離心管中,在-70℃冰箱中保存[6]。取少量花粉置于光學顯微鏡下觀察。

1.2.2 柳樹花粉蛋白質提取液的制備及濃度測定:取100～200 mg的柳樹花粉放入液氮中過夜,在液氮中將花粉研碎;加入 10μL的蛋白酶抑制劑、10μL的苯甲基磺酰氟(PMSF)和1 mL的細胞裂解液,4℃裂解20 min,期間每隔 5 min震蕩 1次;4℃,14 000 r/m in離心30 m in[7],取上清液[8]用超微量分光光度計進行蛋白定量。

1.2.3 建立柳樹花粉引起的過敏性鼻炎小鼠模型[9]:將小鼠隨機分成實驗組和對照組。實驗組分為A、B、C、D四個小組,每組8只小鼠,對照組26只小鼠。將柳樹花粉蛋白提取液混懸于含5%氫氧化鋁的生理鹽水中[10],配成濃度為 1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL和3.0 mg/mL的溶液。腹腔注射0.4 mL/只,對照組注射生理鹽水。實驗組和對照組均每間隔3 d重復注射1次,共7次;第 7次注射后的第6天開始對小鼠進行滴鼻激發。實驗組和對照組小鼠均采用兩個濃度滴鼻,分別為10.6 mg/mL和16 mg/mL,10μL/只,每天 1 次,連續6 d。每次激發完成后30 min內,觀察小鼠打噴嚏、抓鼻等行為學癥狀[8]。

1.2.4 脫敏治療[11]:過敏性鼻炎的小鼠模型成功建立后,每隔5 d皮下注射柳樹花粉蛋白進行特異性脫敏治療。實驗組采用柳樹花粉蛋白提取液進行注射,起始治療階段有兩種濃度:0.16 mg/mL和1.6 mg/mL;維持治療階段一種濃度:1.6 mg/mL。起始治療第一階段每天注射1次,連續3 d,濃度為0.16 mg/mL,劑量依次為0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL;第二階段每天注射 1次,連續 3 d,濃度為1.6 mg/mL,劑量依次為 0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL。維持治療階段從起始治療階段后的第7 d開始,每天注射1次,濃度為1.6 mg/mL,劑量為0.5 mL,維持治療5 d。對照組用生理鹽水進行皮下注射,方法、劑量同實驗組。每次注射后30 min內觀察小鼠的打噴嚏、流鼻涕、抓鼻等癥狀;取小鼠血液,分離血清,檢測血清中特異性sIgE的含量,采用安樂死的方法處死小鼠,取鼻黏膜進行病理學檢查。

1.2.5 小鼠鼻部癥狀的觀察及評分[8]:根據小鼠癥狀,按照以下描述給小鼠計分:①打噴嚏。4個以內1分;4～10個 2分;10個以上 3分。②抓鼻次數。輕度抓鼻(4次以內)1分;頻繁抓鼻(4～10次)2分;抓鼻不止(10次以上)3分。以疊加法記分,總分超過5分即為建模成功。

1.2.6 測定血清中特異性sIgE的含量[12]:小鼠尾靜脈采血[13],分離血清,用ELISA試劑盒測定血清中特異性sIgE的含量。

1.2.7 鼻黏膜病理學檢查[1]:用頸椎脫臼法處死部分小鼠,取雙側鼻腔組織,10%甲醛固定,石蠟包埋,蘇木精-伊紅(HE)染色,光學顯微鏡下觀察鼻黏膜局部病理學變化。

1.3 統計方法

所有計量資料采用(±s)表示,采用SPSS 22.0對數據進行統計學分析。所有計數資料差異性采用P＜0.05表示,差異的顯著性采用SPSS 22.0軟件中非參數檢驗來檢驗。

2 結果

2.1 柳樹花粉的形態

用顯微鏡觀察柳樹花粉的形態,見圖1。

圖1 柳樹花粉(×400)Fig.1 Willow pollen(×400)

2.2 小鼠鼻部癥狀觀察及評分

實驗組小鼠可見頻繁抓鼻子并伴有打噴嚏癥狀,有的小鼠30 min內噴嚏數可高達93次。小鼠打噴嚏、抓鼻等鼻部癥狀,見圖2。經行為學評分后,實驗組小鼠有25只大于5分,空白組小鼠均小于5分,且具有統計學差異(z=-6.627,P＜0.05,非參數檢驗),由此可知建模成功。

2.3 小鼠鼻黏膜組織學檢查

取小鼠的鼻黏膜制作組織學切片,顯微鏡下觀察,空白組小鼠鼻黏膜中未見炎性細胞。實驗組中,用低濃度激發的小鼠,鼻黏膜中可見大量嗜酸性粒細胞浸潤,偶見漿細胞;高濃度激發的小鼠鼻黏膜中可見嗜酸性粒細胞,但比低濃度激發組少,比空白組多,說明低濃度的柳樹花粉蛋白提取液的激發效果更好,建立的過敏性鼻炎模型更典型。治療后小鼠鼻黏膜組織學切片中可見嗜酸性粒細胞明顯比治療前減少,并出現漿細胞,說明脫敏治療有效,見圖3。

圖2 小鼠激發后癥狀注:左側小鼠在滴鼻激發后出現搔鼻現象,同時出現打噴嚏癥狀(瞳孔縮小)Fig.2 Symptoms of mice after nasal stimulationNote:The mouse on the left side was scratching and sneezing after nasal stimulation(pupil reduction)

圖3 各組小鼠鼻黏膜顯微鏡檢查(HE染色,×400)注:A:空白組;B:實驗組(低濃度激發);C:實驗組(高濃度激發);D:治療組Fig.3 Microscopic examination of the nasal mucosa of mice in each group(HE staining,×400)Note:A:blank group;B:experimental group(low concentration stimulation);C:experimental group(high concentration stimulation);D:treatment group

2.4 小鼠血清特異性sIgE含量的測定

對小鼠血清中特異性sIgE含量進行檢測,實驗組小鼠激發后血清特異性sIgE含量有升高的趨勢,脫敏治療后血清中sIgE含量有下降的趨勢,但是差異沒有統計學意義(P＞0.05),見圖4。

圖4 實驗組小鼠各階段血清特異性sIgE含量變化Fig.4 Changes of serum specific sIgE levels in the experimental group at various stages

3 討論

過敏性鼻炎是一種常見病[14],現臨床上多采用口服抗組胺類藥、同時鼻噴激素進行治療,有一定療效,但長期使用會導致不良反應,如過敏癥狀加重、激發輕型哮喘等。花粉是引起過敏性疾病的主要原因,目前特異性脫敏療法[15]是唯一能因病治療過敏性疾病的方法,該方法也可預防發生新過敏原的超敏反應及防止過敏性鼻炎發展為哮喘,但是現在我國臨床成功應用的第一種特異性脫敏治療制劑是塵螨滴劑,只針對塵螨的治療,對其他過敏原引起的過敏性鼻炎的免疫治療還處于研究階段。

鑒于此,本課題采用柳樹花粉來建立過敏性鼻炎的小鼠模型,旨在通過脫敏療法治療過敏性鼻炎,為臨床治療過敏性鼻炎提供一定的依據。本研究采集柳樹花粉、純化提取蛋白質,腹腔注射免疫小鼠、滴鼻激發小鼠。通過對小鼠鼻部癥狀觀察評分、光學顯微鏡觀察鼻黏膜局部病理學變化發現,過敏原激發后,小鼠出現明顯抓鼻、打噴嚏、流鼻涕等癥狀,并且次數較多,鼻黏膜層充血增厚,炎性細胞浸潤,這些結果均表示成功建立柳樹花粉致敏的過敏性鼻炎小鼠模型。

成功建模后,通過遞增變應原劑量的方法皮下注射小鼠,目的是使其產生免疫耐受,從而達到治療過敏性鼻炎的目的。通過動態監測小鼠鼻部癥狀、鼻黏膜組織形態學變化,發現小鼠抓鼻和打噴嚏的次數逐漸減少直至消失、鼻黏膜中嗜酸性粒細胞逐漸減少[16],最后無炎性細胞浸潤,說明脫敏療法治療過敏性鼻炎是非常有效的一種方法。通過對小鼠血清中sIgE含量進行檢測,我們發現,雖然處理的各階段沒有統計學差異(P＞0.05),但仍可以看到,實驗組小鼠激發后血清特異性sIgE的含量有升高的趨勢,脫敏治療后血清中 sIgE含量有下降的趨勢。由此推測,這可能是由于sIgE是微量抗體,血清含量的影響因素較多且不穩定所致。

本實驗利用脫敏的原理,通過注射少量變應原,誘導致敏細胞僅釋放微量活性介質,而不引起臨床癥狀,短時間內多次注射,使致敏細胞內活性介質逐漸耗竭,從而消除機體致敏狀態,成功使患過敏性鼻炎的小鼠得到免疫耐受。但由于臨床上難于確定脫敏階段變應原的劑量以及抗原,限制了脫敏療法在臨床上的廣泛應用。