北京地區實驗大鼠金黃色葡萄球菌的檢測結果及MLST分型分析

馮育芳 邢 進 張雪青 岳秉飛 趙德明

(1.中國農業大學動物醫學院,北京 100094)(2.中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所,北京 102629)

實驗大鼠在生物醫學中應用廣泛,一直是生理、行為、代謝、神經、毒理等研究最常用的實驗動物之一[1-3]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,以下簡稱金葡菌)是一種廣泛分布的細菌,其在空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。金葡菌也是一類病原菌,特定條件下可引起人類或動物多種感染,包括局部化膿性疾病和全身化膿性疾病[4]。值得特別注意的是,新出現的耐甲氧西林金葡菌(MRSA),被稱作超級細菌,幾乎能抵抗所有的抗生素,成為人們關注的重點[5]。鑒于金葡菌的廣泛性、潛在致病性及耐藥性,Jackson Lab和Charles River要求大鼠檢測并排除該細菌,日本石中研則要求免疫缺陷大鼠必須檢測并排除該細菌,我國國標也要求SPF大鼠必須排除[6-7]。因此,本實驗室長期監測北京地區實驗大鼠金葡菌的攜帶情況,并分析其分子特征,探尋其流行趨勢,為實驗大鼠金黃色葡萄球菌的防控提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受檢動物:受檢 SPF級實驗大鼠來自北京市12家實驗動物生產和使用機構。

1.1.2 所用試劑:培養基包括甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(北京三藥科技開發公司,11316)、哥倫比亞血瓊脂培養基(OXIOD公司,CM0331B)、脫纖維羊血(北京陸橋公司,P62)、生化鑒定試劑為BD陽性菌鑒定板(BD公司,448008),DNA提取試劑盒(QIAGEN,69506),Prime STAR HS(TAKARA,R040A),瓊脂糖(TAKARA,5260)。

1.1.3 儀器設備:恒溫培養箱(Thermo Scientific Heraeherm)、生物安全柜(Thermo Scientific A2)、顯微鏡(Nikon)、細菌鑒定儀(BD Phonix-100)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集:觀察實驗大鼠外觀,核對動物編號。斷頸處死動物,將動物仰臥固定,消毒解剖部位。在動物下腹部皮膚剪開一小口,剝開皮膚層后剪開肌肉,將回盲部剪開,取適量內容物接種高鹽甘露醇瓊脂平皿(SP)。

1.2.2 金葡菌的檢測:將已接種的SP培養基置(36±1)℃培養18～24 h。在 SP培養基上形成1 mm左右、凸起、黃色的菌落,菌落周圍的培養基由紅色變成黃色。轉種血瓊脂平皿(36±1)℃培養18～24 h形成白色或金黃色、凸起、圓形、不透明、表面光滑的菌落。革蘭氏染色為陽性球菌,排列成葡萄狀,無芽孢,無莢膜,直徑約為 0.5～0.1μm。 直接用全自動細菌鑒定儀進行鑒定,或參照國標進行手工生化鑒定。結合培養形態、染色以及生化鑒定結果,做出判定。

1.2.3 MLST分型:多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)實驗按照金葡菌MLST網站(http://saureus.mLst.net)提供的方法進行。參照網站的方法合成引物。PCR反應體系為總體積50μL,其中包含 H2O 19μL、2×PCR mix 25μL、上游引物2μL、下游引物2μL、DNA 模板 2μL。 PCR反應條件為98℃10 s、55℃5 s、72℃1 min,共30個循環。PCR后用1.5%瓊脂糖電泳鑒定有無擴增條帶。符合目標長度的陽性條帶產物進行測序。PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果提交網站進行比對,獲得等位基因號和ST型。數據錄入BioNumerics 7.1軟件構建聚類樹。

2 結果

2.1 北京地區實驗大鼠金葡菌的流行趨勢

為了解北京地區實驗大鼠金葡菌的流行趨勢,本實驗室按照國家標準持續對北京地區SPF級實驗大鼠進行抽檢,2008—2017年,每年檢測大鼠106～288只,總計 1956只。檢測結果顯示,每年檢出金葡菌陽性大鼠6～39只,總計165只;每年金葡菌陽性率為3.17%～18.48%,平均陽性率為8.44%,見表1。金葡菌整體陽性率呈先低中高后低的趨勢,在2013年金匍菌大鼠陽性數量和陽性率最高,達到39只和占比18.48%,見圖1。進一步分析金葡菌大鼠檢測的時間分布,結果發現第四季度檢測率最高,但各季節之間沒有統計學差異。這些結果說明,金葡菌在北京地區實驗大鼠中長期廣泛存在,2013年達到陽性峰值,之后陽性率呈逐年下降趨勢,陽性率在季節間的差異不大,見圖2。

表1 2008—2017年北京地區實驗大鼠金葡菌的檢出情況Table 1 Detection of Staphylococcus aureus in laboratory rats in Beijing from 2008 to 2017

圖1 2008—2017年北京大鼠金葡菌的流行趨勢圖Fig.1 Epidemiological Trend of Staphylococcus aureus in laboratory rats in Beijing from 2008 to 2017

2.2 實驗大鼠金葡菌的mLST分型

圖2 2008—2017年北京大鼠金葡菌的流行趨勢圖(分季度)Fig.2 2008—2017 Epidemiological Trend of Staphylococcus aureus in laboratory rats in Beijing(Quarterly)

為了解實驗大鼠金葡菌的分子特征,本實驗室對實驗大鼠來源的148株金葡菌進行了 MLST分型。結果發現,148株菌株共分為7個 ST型別,分別為 ST8、ST3、ST1、ST6、ST2871、ST88、及 ST641,每個ST型包含菌株數1～76株不等。從構成比來看,ST1占比最大,達到 51.35%(76株);其次是ST2871,占比達到30.41%(45株);其余 ST型別占比都小于10%,見表2。從進化上來看,ST1和ST88屬于其中的中間環節,見圖3。在此基礎上,分析不同ST型別在流行時間上的區別。結果發現,2012年之前和2016年ST1占主要位置;2012—2016年,ST2871占比突然增大;2017—2018年ST6占比逐漸升高,占據主要位置,見圖4。分析不同 ST型別在實驗空間上的區別,結果發現,ST1主要流行于A～F、J、M 等八個機構,ST2871 則在 J、H、I等三個機構占主要地位,見圖5。這些結果說明,北京地區實驗大鼠金葡菌具有顯著的時空分布特點,以及進化相關性。

表2 148株金黃色葡萄球菌mLST分析結果Table 2 mLST analysis of 148 strains Staphylococcus aureus

圖3 金黃色葡萄球菌mLST結果的聚類樹Fig.3 Cluster tree of staphylococcus aureus by mLST analysis

圖4 金黃色葡萄球菌型別流行時間分布Fig.4 Time distribution of Staphylococcus aureus by types

3 結論

圖5 金葡菌各型別的空間分布Fig.5 Spatial distribution of Staphylococcus aureus by types

金葡菌是人類的一種重要病原菌,屬于葡萄球菌屬,有“嗜肉菌”的別稱,是革蘭陽性菌的代表。金葡菌在自然界中無處不在,空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到,人體和動物受到污染的機會很多[8]。美國疾病控制中心報告,由金葡菌引起的感染占第二位,僅次于大腸桿菌。

為排除實驗動物的金葡菌,首先要了解其感染情況,2012年葛文平等[9]檢測了5個實驗動物養殖場不同品系SPF級小鼠,發現其金葡菌的攜帶率為1.875%。丁浛高等[10]在揚州大學比較醫學中心13個隔離設施發現部分小鼠攜帶金黃色葡萄球菌。黃偉峰等[11]于2011—2017年從7家實驗動物養殖場采集完成370只實驗動物的金葡菌檢測,共檢出金葡菌31株,總分離率為 12.16%,且均從 SPF大鼠中分離所得。本研究檢測了2008—2017年北京地區實驗大鼠1 956只,檢測到陽性大鼠165只,陽性率為8.44%,說明金葡菌在實驗動物廣泛長期存在,特別是在實驗大鼠群體中,需要特別重視。

分子流行病學可為病原防控提供策略和措施。黃偉峰等[11]從實驗大鼠中檢出金葡菌分成5個型別,其中 T2360為優勢型別,PFGE型別有10個帶型;而且飼養環境中金葡菌的PFGE帶型與2017年SPF大鼠中的細菌帶型完全一致,說明飼養環境中存在的金葡菌與SPF大鼠感染的金葡菌具有緊密聯系[12]。文獻報道Charles River實驗室99株金葡菌大部分屬于 ST88(54.5%),隨后是 ST15、ST5、ST188及ST8[13]。本研究對北京地區實驗大鼠分離到的148株金葡菌進行了MLST分型檢測,結果顯示,北京地區實驗大鼠的金葡菌以ST1為主,其次是ST2871,與國外及國內現有結果均不同。說明北京地區實驗大鼠的細菌來源因為地域或人員引入,需要從這些角度進行防控,確保實驗動物質量[14]。

綜上所述,本研究長期監測了北京地區實驗大鼠的流行趨勢,首次使用MLST分型分析國內實驗大鼠金葡菌的分子特征,為實驗大鼠金黃色葡萄球菌的防控提供了基礎信息,為實驗大鼠金黃色葡萄球菌的檢測提供數據支持,從而保障實驗大鼠的微生物質量。