中國地鼠的剖宮產凈化?

張銳虎 王晨陽 王 璐 余婧婧 王文桃 陳朝陽

(1.山西醫科大學實驗動物中心,太原 030001)(2.實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室,太原 030001)

中國地鼠(Chinese hamster)又名黑線倉鼠,是原產于我國的特色實驗動物資源,在遺傳學、傳染病、糖尿病、腫瘤等方面的研究具有重要的應用價值[1-4]。隨著生命科學的發展,標準化的實驗動物與實驗結果的可靠性、相關制品的安全性密切相關,已成為生命科學研究發展的基礎和重要支撐條件[5]。本研究利用剖宮產獲得的仔鼠,通過由清潔級ICR小鼠代乳的方式對中國地鼠進行了生物凈化,經微生物、寄生蟲檢測達到了清潔級實驗動物的標準,為中國地鼠的推廣應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級中國地鼠、清潔級ICR小鼠均由山西醫科大學實驗動物中心提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(晉)2015-0001。飼養在溫度為(22±2)℃,相對濕度為40%～70%,光照時間為12 h/12 h(光暗交替)的環境中,實驗動物使用許可證號:SYXK(晉)2015-0001,自由攝食飲水。整個飼養和實驗過程嚴格按照3R原則的相關要求對待實驗動物,動物實驗的倫理審批號為SYDL2019011。

1.2 實驗材料

超凈工作臺(蘇凈安泰),恒溫加熱板(其林貝爾),電子秤,剖宮產用手術器械及燒杯、紗布、濾紙等。試劑:2%過氧乙酸,75%酒精,無菌蒸餾水,黃體酮(源葉生物)。

鼠料為實驗地鼠繁殖飼料和大、小鼠繁殖飼料,由江蘇協同醫藥生物工程有限責任公司提供[蘇飼證(2014)01008];國產佳貝艾特 kabrita嬰兒羊奶粉、蛋黃粉(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 中國地鼠預產期的判斷:成年地鼠單籠飼養,每天上午將發情雌鼠放入雄鼠籠中同籠2 h左右,檢查有陰栓時視為交配成功。第12天開始檢查發現陰道口緊閉且有黑色血斑者即可判定妊娠。中國地鼠妊娠期為19～21 d,多在第20天凌晨分娩,于是在交配后第19天晚間肌肉注射3 mg黃體酮,次日上午進行剖宮產手術。

1.3.2 代乳鼠的選擇:選擇母性好、后代生長發育良好,4～6月齡,并且于供體鼠剖宮前 1～2 d生產的經產ICR小鼠作為代乳鼠。

1.3.3 剖宮產術:手術器械和燒杯、紗布、濾紙等高溫滅菌后連同恒溫解剖板等一并放入超凈工作臺,75%酒精及37℃的2%過氧乙酸溶液和無菌蒸餾水備用。

頸椎脫臼處死孕鼠,迅速浸入盛有過氧乙酸溶液的燒杯中5 s,75%酒精噴霧消毒燒杯后傳入超凈工作臺。無菌蒸餾水涮洗地鼠后,置于鋪有滅菌濾紙的37℃ 恒溫解剖板上,75%酒精消毒腹部,開腹充分暴露子宮。3把止血鉗分別夾住子宮頸及兩側的子宮角,分離整個子宮,迅速浸入過氧乙酸中浸泡3 s,蒸餾水沖洗,于滅菌紗布上小心撕破子宮露出幼鼠,剪斷臍帶剝離胎盤,用紗布擦凈幼仔身上特別是口鼻處的黏液和羊水并按摩,使仔鼠呼吸順暢并發聲,體色泛紅后迅速轉入代乳母鼠的IVC籠盒中進行代乳。剖宮產手術在5 min內完成。

1.3.4 代乳:代乳鼠飼養于IVC系統中,代乳前一天更換籠盒和墊料,鋪上滅菌的玉米芯和楊木刨花。染味時先將母鼠移出,每個鼠籠中放入2～3只剖宮產仔鼠,與仔鼠、墊料充分混合后移出部分原窩仔鼠,使仔鼠總數不超過6只,放入代乳母鼠進行代乳,30日齡離乳。代乳期間定時稱體質量,15日齡前每天按摩仔鼠腹部,以促進消化、排便;環境溫度保持22～26℃,相對濕度40%～70%。

人工乳按蛋黃粉(g)∶羊奶粉(g)∶無菌蒸餾水(mL)=1∶5∶25的比例配制,根據供體鼠自交配成功起每天上、下午各一次;代乳鼠懷孕后每天上午一次,從分娩至代乳結束每天上、下午各一次的方案進行添加。輔料為人工乳與適量地鼠繁殖飼料粉末拌勻后,揉搓成棒狀,放置于籠盒底部的盛料臺上,從仔鼠10日齡開始每天上、下午各添加一次。每次添加人工乳和輔料時棄去上次殘留,每天更換一次奶缽和盛料臺。

1.3.5 記錄代乳仔鼠生長曲線與存活率:記錄0～30日齡代乳仔鼠的存活情況、體質量變化趨勢,繪制生長曲線。

1.3.6 繪制自然分娩與代乳地鼠仔鼠的生長曲線:隨機選擇100只自然分娩的中國地鼠仔鼠,記錄0～30日齡仔鼠體質量變化,與ICR小鼠代乳的仔鼠進行比較。

1.3.7 微生物、寄生蟲質量檢測:仔鼠離乳后,從不同窩中隨機選取6只中國地鼠仔鼠進行微生物、寄生蟲質量標準檢測。

1.4 統計方法

采用SPSS 17.0統計軟件對各項原始數據進行分析,實驗數據以平均數±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗,結果以P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 中國地鼠仔鼠的生長曲線和存活率

ICR小鼠代乳的中國地鼠仔鼠體質量均隨著日齡的增長而增加,7日齡前雌、雄仔鼠體質量基本相同,10日齡開始雌性仔鼠的體質量明顯高于雄性仔鼠(P＜0.01,P＜0.001),所有仔鼠在14日齡開始體質量迅速增長(圖1A)。比較代乳與自然分娩的中國地鼠仔鼠0～30日齡體質量變化,發現這兩種處理方式下中國地鼠仔鼠同性別間的體質量變化差異無顯著性(P＞0.05),說明通過ICR小鼠代乳中國地鼠仔鼠,可以滿足中國地鼠對營養、生長環境等的需求(圖 1B)。

圖1 中國地鼠仔鼠的生長曲線注:與雄性仔鼠比較,??P＜0.01,???P＜0.001Fig.1 The growth curves of the offspring of milk substitute Chinese hamstersNote:Compared with the male offspring,??P＜0.01,???P＜0.001

本次實驗共剖宮24窩中國地鼠,獲得仔鼠109只,其中有4窩共出現了5只死胎仔,3日齡時存活的仔鼠數為78只,7日齡時存活的仔鼠數為59只,14日齡時存活的仔鼠數為57只,離乳時存活的仔鼠數為56只,代乳成功率為53.85%(表1)。

表1 中國地鼠仔鼠剖宮產及代乳存活情況Table 1 Caesarean section and fostering results of the offspring of Chinese hamster

2.2 代乳組仔鼠微生物和寄生蟲指標檢測結果

經檢測,未檢出清潔級地鼠要求排除的微生物和寄生蟲,達到清潔級國家標準(表2)。

表2 生物凈化后中國地鼠仔鼠微生物和寄生蟲檢測結果Table 2 Pathogen test results of the offspring of Chinese hamster after caesarean section

結論:依據GB 14922.1—2001和GB 14922.2—2011,經檢驗,該中國地鼠微生物和寄生蟲指標符合清潔級實驗動物要求。

3 討論

中國地鼠是我國特有的實驗動物資源,本實驗通過剖宮產并利用ICR小鼠代乳的方式對其進行了生物凈化。分娩前的24 h仔鼠生長發育最旺盛,近20%的初生體質量在這段時間完成,且對幼仔的成活率影響很大,人們通常采用觸摸和觀察的方法判斷預產期[6-7]。中國地鼠尾短、皮膚緊致,抓取固定多采用握拳式,母鼠臨產時腹部鼓脹,為避免觸摸檢查擠傷胎仔,我們通過固定同籠時間,及時進行陰栓、妊娠檢查,結合妊娠周期和分娩規律推算分娩時間,并采用在產前肌肉注射黃體酮的方式很好地完成了剖宮產手術。

ICR小鼠性情溫順、產乳周期長,代乳實驗中常通過添加人工乳和輔料的方式,為仔鼠提供多種營養供給[6-8]。本研究中我們根據妊娠期中國地鼠和哺乳期ICR小鼠的飼養操作規程,從增加供體母鼠、代乳母鼠和仔鼠的營養,制定了人工乳和輔料的添加方案。保障了供體母鼠的營養攝取、提高了仔鼠出生質量,也加強了代乳母鼠的營養供給,仔鼠通過采食人工乳和輔料的活動,既增加了營養攝入又增強了體質,并最終代乳成功。

代乳過程中的觀察稱量、輔料添加等活動對鼠只的正常生活干擾較大,一個舒適、安全的籠盒內環境能減少應激。相關研究發現,常用的幾種墊料材質中木屑的粉塵較多;草紙易被叼于一處,使籠盒內氣流不暢;玉米芯吸水性好,但干燥速度相對較慢且筑巢性差;楊木刨花的筑巢、保溫、干燥速度優于玉米芯,但吸水性差、粉末率要高于玉米芯[6,9-10]。我們采用玉米芯加楊木刨花的方式既滿足了母鼠做窩的習性又改善了籠盒內環境,很好地完成了代乳實驗。

綜上所述,本研究對中國地鼠成功實施了生物凈化,達到了清潔級中國地鼠質量標準,為中國地鼠的應用提供了保障。同時,也從預產期判斷、營養供給、墊料搭配等方面進行了嘗試,并取得了一定效果。