3D支架載尿液細胞來源IPSCs-NSCs移植對急性脊髓損傷大鼠的修復作用觀察

李長明，邵榮學，鄧小梅，趙士杰，王拓，全仁夫 杭州市蕭山區中醫院，杭州300；杭州市中醫院

脊髓損傷(SCI)是一種嚴重的中樞神經系統損傷，具有較高的致殘率，目前尚無效果很好的治療方法。隨著醫療技術水平的不斷提高，生物支架以其良好的生物相容性被越來越多地應用于外科手術中。SCI的主要病理機制是軸突失連、神經細胞凋亡壞死等，導致機體不能進行有效的信號傳導。誘導性多能干細胞(IPSCs)能將某些轉錄因子通過基因轉染技術導入動物或人的體細胞內，使體細胞直接重構成為胚胎干細胞樣的多潛能細胞；重構后的細胞具有與胚胎干細胞相似的自我更新能力和發育多潛能性，并可有效避免倫理問題，為SCI患者的康復帶來了希望。2017年5月～2018年5月，本研究通過對尿液細胞進行重編程建立IPSCs，并對其進行神經干細胞(NSCs)方向的定向誘導分化，再將3D打印支架載IPSCs來源的NSCs移植至急性SCI大鼠的受損脊髓，觀察其對受損脊髓的修復作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：成年雄性SD大鼠56只，SPF級，體質量(220±10)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。主要試劑：膠質纖維酸性蛋白(GFAP，ab53554)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，aladdin P133293)、生長相關蛋白43(GAP-43，ab75810)、微管蛋白(β-tubulin Ⅲ，ab52623)均購于美國Abcam公司，硫酸肝素購于美國Sigma公司，巢蛋白抗體(Nestin，OM264981)購于美國OmnimAbs公司，神經元特異性烯醇化酶(NSE，bs-10445R)購于中國Bioss公司。主要儀器：熒光顯微鏡(CKX53)購于日本Olympus公司，3D打印機購于杭州捷諾飛生物科技有限公司，冷場發射高分辨掃描電鏡(S-4300)購于日本Hitachi公司。

1.2 尿液細胞來源IPSCs向NSCs的定向分化及鑒定

1.2.1 尿液細胞來源IPSCs的分離 經杭州市蕭山區中醫院倫理委員會同意，采集1例23歲健康男性志愿者的尿液200 mL作為實驗標本。參照Zhou等[1]的方法分離尿液細胞并重編程為IPSCs，方法如下：收集尿液進行細胞培養，按1∶2～1∶3傳代。取第3代尿液細胞(呈現纖維樣或上皮樣，狀態良好)，使用Amaxa Basic Nucleofector試劑盒進行電轉染。待IPSCs克隆出現后，以堿性磷酸酶檢測試劑盒進行堿性磷酸酶活性檢測(AP染色)。AP染色結果顯示，尿液細胞來源的IPSCs克隆呈陽性。

1.2.2 IPSCs的鑒定 用玻璃針收集IPSCs克隆，并按1∶3～1∶5傳代。使用4%多聚甲醛室溫下固定15 min，0.25%(V/V)Triton X-100/PBS透膜10 min，室溫下4%(W/V)BSA封閉1 h。4 ℃條件下加入抗OCT4(1∶350，兔多克隆)、抗NANOG(1∶1 000，兔單克隆)、抗TRA-1-81(1∶100，小鼠單克隆)、抗TRA-1-60(1∶100，小鼠單克隆)一抗孵育過夜，室溫條件下加入山羊抗兔Alexa Fluor 488或568、山羊抗鼠Alexa Fluor 647二抗孵育30 min，以DAPI進行細胞核染色，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。結果顯示，細胞核經DAPI染色呈現藍色熒光，IPSCs特異性免疫標記物OCT4、NANOG、TRA-1-81、TRA-1-60均呈陽性表達。

1.2.3 IPSCs向NSCs的誘導分化 將消化下來的IPSCs集落移至培養皿中，差速貼壁 30 min，去除分化細胞及飼養層細胞，收集懸浮細胞集落。用EB培養基重懸，轉移至細菌培養皿中懸浮培養，隔天換液。懸浮培養4 d即形成成熟的擬胚體(EBs)，應用維甲酸(RA)+無血清培養基誘導，在EBs培養基中誘導培養4 d，換成無血清培養基貼壁培養。將篩選培養得到的神經球樣克隆命名為IPSCs-NSCs。

1.2.4 IPSCs-NSCs的鑒定 ①免疫熒光鑒定：取1.2.3誘導分化后的細胞，將已爬好細胞的培養皿用4%多聚甲醛固定15 min，在培養皿內滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min，移液槍吸掉封閉液；培養皿內滴加一抗Nestin(1∶200)，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗，移液槍吸干培養皿內多余液體后滴加FITC(1∶100)熒光二抗，37 ℃孵育45 min；PBS沖洗，滴加DAPI避光孵育5 min進行細胞核染色。PBS沖洗多余的DAPI，50%甘油封閉培養皿。熒光顯微鏡下顯示IPSCs-NSCs特異性標志物Nestin表達陽性，呈現綠色熒光，細胞核經DAPI染色呈現藍色熒光，證實該細胞為IPSCs-NSCs。②分化能力檢測：取1.2.3誘導分化后的細胞，置于含10%胎牛血清的培養基中培養，培養瓶先用0.1%明膠包被，觀察細胞形態變化，采用免疫熒光檢測β-tubulinⅢ和GFAP表達。結果顯示，GFAP目的蛋白呈現紅色熒光，細胞核經DAPI染色呈現藍色熒光，細胞向周圍延伸，提示細胞分化能力良好；β-tubulinⅢ目的蛋白呈現紅色熒光，細胞核經DAPI染色呈現藍色熒光，β-tubulinⅢ星形膠質細胞大量表達，提示細胞分化能力良好。證實成功進行IPSCs向NSCs的定向分化，并制備IPSCs-NSCs。

1.3 海馬來源NSCs(Hd-NSCs)的分離、培養及鑒定

1.3.1 Hd-NSCs的分離、培養 將新生(出生24 h內)的SD大鼠乙醇浸泡5 min，取出置于超凈平臺中；沿后中線開顱，Hanks液沖洗腦膜，取整個腦組織置于預先放有解剖液的無菌培養皿中；分離、取出海馬齒狀回，并剪碎、吹打；150目濾網過濾細胞勻漿，Hanks液清洗后加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃條件下消化30 min，棄胰酶、加入DMEM/F12培養液終止消化，銅網過濾并離心，制成單細胞懸液。0.4%臺盼藍染色觀察細胞存活率，細胞計數后接種，調整細胞密度為4×105～5×105/mL。培養液為添加B27(2%)、bFGF(20 ng/mL)、EGF(20 ng/mL)的DMEM/F12無血清培養基。細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中懸浮培養，隔日換液。

1.3.2 Hd-NSCs的鑒定 ①SABC免疫細胞化學染色：培養第6天，顯微鏡下可見神經球，離心后制備單細胞懸液；吹打并取出少量滴加于經多聚賴氨酸處理的蓋玻片上，表面加少量DMEM無血清培養基，PBS液洗滌，冷風吹干。4%多聚甲醛固定，6 h后行常規SABC免疫細胞化學染色，一抗為Nestin (1∶400)。熒光顯微鏡下觀察Hd-NSCs特異性蛋白Nestin呈現紅色熒光，細胞核經DAPI染色呈現藍色熒光。②Hd-NSCs向神經元方向分化能力觀察：將培養3代的懸浮生長的細胞克隆離心(500 r/min)，吹打為單細胞懸液，種植在經多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，放于6孔培養皿中。每天觀察細胞生長狀態，常規換液。在分化1、3、5、7 d時，取出蓋玻片，常規進行NSE免疫細胞化學染色(一抗工作液濃度1∶200)，同時觀察神經元的形態變化。結果顯示，隨著分化時間的延長，NSE表達增加，提示細胞分化能力良好。③神經元鑒定:參照1.2.3的培養條件，將神經球種植于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，添加含有10%胎牛血清、NGF(1 ng/mL)、IGF-1(2 ng/mL)、胰島素(25 μg/mL)的DMEM/F12培養基分化細胞。分別于分化1、3、5、7 d取出載玻片，進行漂洗、固定、常規SABC免疫細胞化學染色，DAB顯色，熒光顯微鏡觀察GAP-43的表達。結果顯示，隨著分化時間的延長，Hd-NSCs特異性蛋白GAP-43表達增加，提示神經元發育與再生能力良好。

1.4 3D打印脊髓支架(簡稱3D支架)的制備 采用3D打印技術聯合真空冷凍干燥法。取Ⅰ型膠原蛋白100 mg、Ⅱ型膠原蛋白10 mg以及硫酸肝素1 mg，加入 PLGA 200 mg，充分混勻。打開氮氣，將配制好的漿料置于物料桶內，設置好分壓。選擇打印針頭并進行物料出料校準，設置與調節打印參數，包括出料溫度、平臺溫度等。三維支架成型，室溫下放置4 h以上，45、60 ℃分別恒溫干燥箱中持續干燥12 h。100倍電鏡下觀察顯示，制備的3D支架具有完美的內部三維立體多孔結構，支架橫截面掃描電鏡顯示內部呈三維立體疏松多孔結構，孔徑大小為50 μm左右。

1.5 支架細胞預處理 將3D支架截成2～3 mm的小段，置于干細胞培養基中浸泡48 h，在無菌操作臺中風干，滅菌備用。將IPSCs-NSCs和Hd-NSCs培養至第7天時，消化計數；將1×106個細胞濃縮為0.2 mL，分別滴于預處理過的3D支架上，置于培養箱中2 h，用于后續實驗。

1.6 建模與分組處理 將56只SD大鼠按照隨機數字表法分為4組，每組14只。各組均按照以往的方法[2]用可控性皮質脊髓撞擊儀構建急性SCI模型，以開放領域運動測試(BBB)評分為0分定義為建模成功。常規護理1周，采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 mg)進行腹腔注射麻醉，去除椎板，將損傷處的脊髓切除2～3 mm。IPSCs-NSCs組植入1.5中載IPSCs-NSCs的3D支架，Hd-NSCs組植入1.5中載Hd-NSCs的3D支架，模型組植入DMEM培養液0.2 mL，支架模型組植入載DMEM培養液0.2 mL的3D支架。

1.7 修復效果評價 ①BBB評分：術后2～8周，對各組大鼠后肢的運動情況進行BBB評分，BBB總分為21分，分數越高表示運動情況越好；②Tarlov、Rivlin評分：術后8周采用Tarlov和 Rivlin評分對各組大鼠后肢的運動功能進行評價，Tarlov、Rivlin評分越高表示運動功能越好；③運動、感覺誘發電位：術后8周采用誘發電位儀檢測各組大鼠的運動、感覺誘發電位；④病理觀察：術后8周處死各組大鼠，取受損節段脊髓組織，制備石蠟切片，HE染色觀察病理改變。

2 結果

2.1 各組大鼠術后不同時間點BBB評分比較 見表1。

表1 各組大鼠術后BBB評分比較(分，

2.2 各組大鼠Tarlov、Rivlin評分比較 見表2。

表2 各組大鼠Tarlov、Rivlin評分比較(分，

2.3 各組運動、感覺誘發電位比較 IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組運動和感覺誘發電位潛伏期均短于模型組、支架模型組，運動和感覺誘發電位振幅均高于模型組、支架模型組(P均<0.05)。IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組運動和感覺誘發電位潛伏期、振幅比較差異均無統計學意義，支架模型組、模型組上述指標比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠運動、感覺誘發電位比較

2.4 各組病理改變比較 模型組脊神經受到損傷，組織水腫，細胞稀疏，細胞間隙明顯增大；支架模型組細胞生長較模型組稍緊密，空泡減少；IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組脊神經生長良好，組織生長間隙縮小，空泡減少，無組織水腫。

3 討論

急性SCI常見于暴力性外傷，具有較高的致殘率及病死率[3]。SCI的治療以外科手術為主，藥物及康復為輔，但這些常規治療方法缺乏特異性且療效不佳。近年來，組織工程學的興起給SCI的治療提供了新方向，生物支架+種子細胞+神經因子的聯合移植修復被認為是治療神經損傷的最佳療法[4, 5]。NSCs具有永久的增殖能力及多向分化功能，可分化成星形和少突膠質細胞、神經元，具有營養神經、調節免疫和修復神經損傷的作用，在治療神經系統疾病中的前景較好[6]。但是，來源于人類胎兒組織或者胚胎干細胞的NSCs通常存在倫理問題。IPSCs可將目的基因克隆到病毒載體中，然后導入機體成纖維細胞中，誘導其分化，并且不會發生免疫排斥[7]。IPSCs可以作為NSCs的來源，但IPSCs本身提取效率較低，導致該技術應用受限。目前，IPSCs可以從人成纖維細胞、人角質細胞[8]、小鼠肝臟細胞[9]、人臍帶血細胞[10]以及脂肪來源細胞[11]中通過重編程獲得，但是大部分方法是有創取樣，導致樣本收集十分困難。

Zhou等[1]首次將人尿液細胞誘導為IPSCs，該方法具有無創且費用低的優點。人體腎小管網絡龐大，每天有2 000～7 000個細胞從尿道、輸尿管上皮、膀胱、腎小管上皮脫落，并隨尿液排出體外[12]。這些細胞大部分保留有正常的功能且容易獲得，是進行體外研究的理想細胞來源。本研究成功收集了尿液細胞為細胞來源并誘導出IPSCs，且該IPSCs特異性免疫標記物OCT4、NANOG、TRA-1-81、TRA-1-60均呈陽性表達。宋旆文等[13]利用體外實驗制備骨髓間充質干細胞條件培養基，將其與NSCs共同培養，發現條件培養基可以促進神經干細胞向神經元的分化，而向星形膠質細胞的分化減少。本研究結果顯示，IPSCs-NSCs在培養基中穩定增殖，體積不斷增大，培養液中神經球數量亦不斷增多；GFAP目的蛋白呈現紅色熒光，細胞核經DAPI染色呈現藍色熒光，細胞向周圍延伸，提示細胞分化能力良好；β-tubulinⅢ目的蛋白呈現紅色熒光，細胞核經DAPI染色呈現藍色熒光，提示細胞分化能力良好。這證實成功將尿液細胞重編程為IPSCs，并誘導其分化為NSCs。

生物支架與種子細胞具有良好的相容性是組織工程學治療SCI的基礎，生物支架在治療中應確保種子細胞保留在脊髓損傷部位，從而發揮調節微環境、填充病變腔并誘導其定向生長的作用[14]。3D支架是中空多孔的結構，為上下行傳導束的重建和軸突生長提供通道，并除去物理隔離，對改善其物理微環境具有重要作用。本研究打印的3D支架孔徑約為50 μm，為細胞依附和增殖提供有利空間。曹宗銳等[15]研究顯示，采用膠原硫酸肝素制備的3D支架與NSCs具有較好的相容性。本研究Hd-NSCs和IPSCs-NSCs均能在3D支架孔中黏附、存活以及生長，表明該3D支架為Hd-NSCs和IPSCs-NSCs提供了較好的微環境，該3D支架與細胞之間具有較好的相容性。

脊髓損傷后局部膠質瘢痕形成，上下行神經傳導束中斷，微環境受損。因此，完整的脊髓是保證完整的纖維束、神經元間互相正常聯絡的關鍵[16]。張仁坤等[17]采用生物支架聯合神經細胞治療SCI，結果顯示患者的BBB評分、神經電生理評分均明顯改善。Ren等[18]對SCI犬進行組織工程學治療，結果發現其治療后的運動及纖維再生能力明顯改善。本研究結果顯示，IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組術后2～8周BBB評分、神經電生理檢測結果以及術后8周的Tarlov、Rivlin評分均高于模型組和支架模型組，而IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組比較并無統計學差異。本研究病理觀察結果顯示，IPSCs-NSCs組、Hd-NSCs組脊神經纖維生長良好，組織生長間隙縮小，空泡減少，無組織水腫；這表明尿液細胞來源IPSCs-NSCs移植能促進脊神經纖維生長，為神經細胞生長提供較好的微環境，其效果與Hd-NSCs相當。