手足口病毒誘導腸上皮細胞差異表達miRNA的篩選及其在患兒糞便標本中的診斷效能分析

熊英，唐曉磊，朱芮 武漢大學中南醫院，武漢43007；皖南醫學院第二附屬醫院

手足口病以糞口途徑傳播為主，是一種在嬰幼兒群體中廣泛流行的病毒性疾病[1]，腸病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(CA16)是導致其發生的主要流行病原體[2,3]。這兩種病原體主要誘發以發熱、皰疹為表現的臨床癥狀，但是CA16感染主要引發持續性的、較為緩和的發熱癥狀，而EV71通常會導致較為嚴重的、中樞神經系統癥狀[4～6]。目前，針對手足口病不同亞型病毒的檢測有血清IgM法、核酸PCR法及病毒分離培養法，對實驗條件的要求較高，且與標本采集質量關系密切。miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，對多項細胞生理功能發揮多重調控作用[7]。病原體可影響宿主miRNA表達，而宿主表達變化miRNA也能作為檢測某種病毒感染的特異性標志物[8,9]。2017年1月～2019年1月，本研究觀察了EV71及CA16對人腸上皮細胞系(HIEC)miRNA表達的影響，并以此篩選出具有相對普遍性的miRNA作為診斷標志物，分析其聯合檢測在手足口病患兒糞便標本中的診斷效能?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 ①病毒：EV71(EV71-C4亞型，GenBank: EU812515.1)、CA16(CA16-G20亞型，GenBank: JN590244.1)均由武漢大學病毒研究所分離保存。②細胞：HIEC購于武漢大學細胞菌種典藏中心。③主要試劑：青-鏈霉素雙抗購于北京索萊寶生物技術有限公司，miRNA提取試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購于美國Thermo Fisher公司，miRNA微陣列芯片購于北京博奧芯片生物技術有限公司；EV71型IgM抗體酶聯免疫診斷試劑盒、CA16型IgM抗體膠體金法檢測試劑盒購于北京萬泰生物藥業有限公司，EV71/CA16雙重熒光RT-PCR檢測試劑盒購于廣州健侖生物技術有限公司；糞便RNA提取試劑盒購于寧波重鼎生物技術有限公司。④臨床分離病毒株：收集來自3個不同地域(安徽阜陽、湖北武漢和廣東廣州)的臨床手足病患兒分離的病毒株共46株，其中EV71 35株、CA16 6株、CA其他亞型5株。

1.2 手足口病毒誘導HIEC差異表達miRNA篩選

1.2.1 EV71、CA16感染 將擴增得來的EV71、CA16分別懸于無菌生理鹽水中，均勻分散，測得260 nm處光密度值，以此計算病毒數量，加入DMEM完全培養基重懸后備用。取對數生長期的HIEC，用含10%胎牛血清的DMEM培養基調整細胞密度為2×106/mL，置于細胞培養箱中培養48 h；隨后換液，保留貼壁細胞，按照病毒∶細胞為10∶1的比例分別加入EV71、CA16。

1.2.2 EV71、CA16感染后差異性表達miRNA篩選 采用miRNA微陣列芯片分析。兩種病毒感染0、24、48、96 h時分別收集細胞，提取總RNA備用。取RNA 100 ng，用Cy標記，變性后在微陣列芯片上雜交，芯片上含有捕獲miRNA的探針；通過芯片晶芯luxScan10K微陣列芯片掃描儀讀取熒光成像，并采用軟件量化雜交信號;以U6為內參，在Sanger miRBase數據庫中列出差異表達的miRNA，并計算相對于感染0 h的表達變化倍數。以P<0.05且相對變化倍數>2定義為有意義的miRNA。

1.2.3 具有相對普遍性的差異表達miRNA篩選 采用實時熒光定量PCR法。將HIEC分為觀察組和對照組，觀察組參照1.2.1的方法培養及感染臨床手足口病患兒分離病毒株46株，對照組不感染病毒株。培養72 h提取兩組細胞的總RNA，使用TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒對總RNA進行逆轉錄。6個差異表達miRNA及內參U6引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.3 差異性表達miRNA在手足口病患兒糞便標本中的診斷效能分析

1.3.1 臨床資料 選擇武漢大學中南醫院2017年5～9月收治的手足口病患兒40例，男23例、女17例，年齡(39.8±16.3)個月；患兒就診時間均為出現癥狀(發熱、厭食、皰疹)當天，手足口病診斷標準參照衛計委頒布的《手足口病診療指南(2010年版)》。選擇同期與患兒性別、年齡匹配的健康體檢兒童52例作為對照。本研究通過醫院倫理委員會審核，受試者監護人均簽署知情同意書。

表1 6個差異表達有意義的miRNA及內參U6引物序列

1.3.2 診斷方法 ①糞便miRNA聯合檢測法：收集患兒和健康兒童隨機糞便0.15 g，采用糞便RNA提取試劑盒提取總RNA，實時熒光定量PCR法檢測4個升高幅度較大的miRNA相對表達量，操作方法參照1.2.3。以上4個miRNA中任意3個或4個miRNA升高定義為陽性。②血清IgM抗體檢測法：收集患兒和健康兒童全血2 mL，待血液凝固后，3 000 r/min離心15 min，取上層血清。嚴格按照EV71型IgM抗體酶聯免疫診斷試劑盒及CA16型IgM抗體膠體金法檢測試劑盒說明書進行操作，并根據說明書判讀陰性或陽性。③咽拭子病毒核酸檢測法：收集患兒和健康兒童咽拭子，在無核酸酶管中加入1 mL裂解液，充分混勻，嚴格按照說明書操作。將提取獲得的RNA用25 μL無RNA酶的去離子水溶解，并進行實時熒光定量PCR檢測。待測模板初始拷貝量的負對數與檢測Ct值線性分析由實時熒光PCR儀自動生成。

2 結果

2.1 EV71、CA16感染HIEC后的miRNA表達變化 miRNA微陣列芯片檢測了164個miRNA，只有少數幾個miRNA表達降低且相對降低倍數<2，大多數miRNA表達上調，其中表達上調有意義的前6個miRNA是miR-526a、miR-23b、miR-619-5p、miR-204-5p、miR-5585-3p和miR-146a。見表2。

表2 EV71、CA16感染HIEC后表達上調有意義的前6個miRNA相對表達量變化

2.2 兩組6個miRNA相對表達量比較 觀察組miR-526a、miR-23b、miR-619-5p、miR-204-5p、miR-5585-3p和miR-146a相對表達量均明顯高于對照組(P均<0.01)，見表3。選擇4個升高幅度較大的miRNA(miR-23b、miR-619-5p、miR-204-5p、miR-5585-3p)作為后續糞便miRNA聯合檢測的靶標。

表3 兩組6個miRNA相對表達量比較

2.3 3種檢測方法對手足口病的診斷效能比較 3種檢測方法的檢出結果見表3，診斷手足口病的ROC曲線見圖1。糞便miRNA聯合檢測法對手足口病的陽性檢出率為87.50% (35/40)、靈敏度為90.91%、特異度為84.09%、準確性為92.30%、陽性預期值為94.59%、陰性預期值為90.90%，血清IgM抗體檢測法對手足口病的陽性檢出率為37.50%(15/40)、靈敏度為63.64%、特異度為85.71%、準確性為70.60%、陽性預期值為88.23%、陰性預期值為66.67%,咽拭子病毒核酸檢測法對手足口病的陽性檢出率為90.00%(36/40)、靈敏度為88.64%、特異度為92.86%、準確性為95.65%、陽性預期值為100%、陰性預期值為92.85%。

表3 手足口病患兒與健康兒童3種檢測方法的檢出結果

圖1 3種方法診斷手足口病的ROC曲線

3 討論

目前，對手足口病病原體EV71的疫苗已經應用于臨床，并能夠有效針對EV71發揮作用，但對其他亞型病毒的作用有限[6]。鑒于手足口病的傳播途徑，本次研究使用miRNA芯片分析了EV71和CA16誘導HIEC的164個miRNA表達變化，結果顯示HIEC感染病毒株后多數 miRNA表達為上升趨勢，僅少數為降低趨勢；本研究僅將上升趨勢較為顯著的6個miRNA列出，且以不同區域的46株臨床分離株分別感染HIEC，結果顯示miR-5585-3p、miR-23b、miR-619-5p和miR-204-5p表達仍處于高水平，提示這4個miRNA的持續高表達可能參與了手足口病病毒感染宿主細胞的過程。

研究顯示，miR-5585-3p在彌散型淋巴瘤中高表達，且與患者預后密切相關[11]。而本次研究報道發現，其在感染手足口病毒的HIEC中表達水平較高，在手足口病患兒的糞便中表達也較高。miR-23b是一種Notch2受體相關miRNA，已有關于miR-23b與胃癌發生相關的報道[12]。本研究中感染手足口病毒的HIEC中miR-23b表達升高，提示EV71、CA16病毒在侵襲過程中可能啟動了Notch通路，有待進一步證實。miR-619-5p與腸道的相關研究表明，其通過影響轉錄因子MALAT1而對結腸腫瘤患者的預后有影響[13]。本次研究HIEC在手足口病毒感染后也表達出較高水平miR-619-5p，提示miR-619-5p對腸道病變有一定的指示作用，且手足口病病毒對腸道的損傷機制可能與MALAT1有一定的相關性。國內有研究報道，miR-204-5p與直腸癌腸上皮細胞的惡化以及腸易激綜合征關系密切[14,15]。研究發現，在腸易激綜合征患者中miR-204-5p與類胰蛋白酶表達有關，這可能與手足口病患兒的腹瀉癥狀有關[15]。

本研究以篩選獲得的4個高表達miRNA進行糞便miRNA聯合檢測，并與其他檢測方法進行了對比。結果顯示，糞便miRNA聯合檢測法的陽性檢出率遠高于血清IgM抗體檢測法，可能與IgM的檢測方法學以及機體免疫力、標本留取的階段有關[16]。咽拭子病毒核酸檢測法已成為目前臨床最常見的手足口病檢測手段，現有雙重熒光及三重熒光等商品化檢測試劑盒。本研究發現，咽拭子病毒核酸檢測法對健康兒童的檢測性能優于手足口病患兒。本研究同一批次的檢測中發現2例健康兒童同時被糞便miRNA聯合檢測法和血清IgM抗體檢測法檢測為陽性，但咽拭子病毒核酸檢測法卻為陰性。因該2例兒童無任何明顯的臨床癥狀且糞便及咽拭子病毒核酸檢測法重復檢測均為陰性，考慮這2例兒童可能處于潛伏感染期，且為一過性感染，因此無明顯的臨床癥狀；而復檢的時候無病毒存在，故糞便及咽拭子病毒核酸檢測法重復檢測均為陰性。

綜上所述，EV71和CA16誘導HIEC表達明顯升高的miRNA分別為miR-5585-3p、miR-23b、miR-619-5p、miR-204-5p，以其作為靶標進行糞便miRNA聯合檢測對手足口病的診斷效能高于血清IgM抗體檢測法和咽拭子病毒核酸檢測法。