不同發育天數囊胚移植策略分析

漆倩榮，羅金，王雅琴，謝青貞

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，武漢 430060)

近年來，囊胚移植已經逐漸取代卵裂期胚胎移植，成為大部分生殖中心胚胎移植的主流方案。與卵裂期(D3)胚胎相比，囊胚移植可顯著提高IVF/ICSI-ET助孕患者的臨床妊娠率和活產率[1-2]。但是如何進一步提高囊胚的種植率與妊娠率，依然是生殖醫學學者密切關注的熱點問題之一。根據發育天數不同，囊胚多分為第5天(D5)囊胚和第6天(D6)囊胚。近年來，國內外大量學者對新鮮周期和凍融周期D5與D6囊胚移植妊娠結局進行了分析，但結果并不一致[3-6]。本研究回顧性分析了我中心2015年1月至2017年10月進行囊胚移植的新鮮周期和凍融周期，比較D5和D6囊胚在新鮮周期和凍融移植周期中的妊娠結局，以期探索最佳的囊胚移植策略。

資料與方法

一、研究對象與分組

回顧性分析2015年1月至2017年10月在我院生殖中心行囊胚移植的患者資料。根據移植方案不同分為新鮮囊胚移植周期組(新鮮周期，256例)和凍融囊胚移植周期組(凍融周期，564例)。根據囊胚的發育天數不同，各組又分別分為D5囊胚組和D6囊胚組，其中新鮮周期中D5囊胚組157例，D6囊胚組99例；凍融周期中D5囊胚組350例，D6囊胚組214例。

納入標準：(1) 在我中心行IVF/ICSI-ET助孕并行新鮮周期或凍融周期囊胚移植的患者；(2)女方年齡<42歲；(3)采用我中心標準長方案或拮抗劑方案進行促排卵。

排除標準：(1)同一凍融周期中同時移植D5和D6囊胚的患者；(2)有宮腔粘連等明確影響胚胎著床因素的患者。

二、治療方案

1.控制性促排卵、受精和胚胎培養：根據患者情況采用本中心標準長方案或拮抗劑方案促排卵，定期B超監測卵泡發育情況并測定血清卵泡刺激素(FSH)、雌激素(E2)、黃體生成素(LH)、孕酮(P)水平，調整促性腺激素(Gn)用量。適時給予HCG 5 000～10 000 U進行扳機。36 h后在陰道超聲下取卵。根據男方精液參數行IVF或ICSI受精，IVF受精4 h后通過觀察極體排出情況決定是否需要行補救性ICSI。釆卵后第1天觀察卵母細胞受精情況。釆卵后第3天將胚胎轉移至囊胚培養液中繼續培養，第5天和第6天觀察囊胚形成情況并采用Gardner囊胚等級評分系統[7]進行囊胚分期和評分。即根據囊胚腔擴張程度分為1～6期，根據內細胞團(ICM)和滋養細胞層(TE)細胞數分為A、B、C三個等級。選取正常受精的可利用囊胚(3期以上ICM/TE不同時為C級)進行移植或冷凍。根據ICM/TE評分將可利用囊胚再分為優質囊胚(ICM/TE評分為AA，AB或BA)、次優囊胚(ICM/TE評分為BB)及低等級囊胚(ICM/TE評分有一項為C)。

2.囊胚冷凍復蘇與胚胎移植：新鮮周期根據囊胚發育天數在釆卵后第5天或第6天進行移植。凍融周期中，所有的囊胚均采用玻璃化冷凍法進行冷凍復蘇，具體操作方法見本中心已發表文獻[8]。擬行冷凍囊胚移植的患者，根據患者月經周期情況采用人工周期或自然周期行內膜準備，分別于黃體酮轉內膜或排卵后第5天進行胚胎復蘇，培養2～4 h后移植。

3.移植后處理與隨訪：移植后給予每日黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)40 mg肌注及地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭)20 mg口服進行黃體支持。胚胎移植后14 d查血HCG，若為陽性，則于移植后30～35 d行B超檢查觀察孕囊和胎心搏動。移植后3個月電話隨訪是否有早孕流產或異位妊娠。

4.分析指標：比較各組間患者年齡、不孕年限、體重指數(BMI)、不孕原因、不孕類型；促排卵/內膜準備方案、胚胎移植日子宮內膜厚度、移植胚胎數目、胚胎質量；臨床妊娠率、胚胎種植率、異位妊娠率和流產率等。

三、統計學方法

結 果

一、各組間患者一般情況比較

本研究共納入820個周期的患者資料，其中新鮮周期D5囊胚組157例，新鮮周期D6囊胚組99例，凍融周期D5囊胚組350例，凍融周期D6囊胚組214例。四組間患者年齡、不孕年限、BMI、不孕類型、不孕原因均無顯著性差異(P>0.5)；新鮮周期D5囊胚組和D6囊胚組促排卵方案無顯著性差異(P>0.5)；凍融周期D5囊胚組和D6囊胚組內膜準備方案差異也無統計學意義(P>0.5)(表1)。

表1 患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

二、各組間患者實驗室資料比較

四組患者間獲卵數、受精方式無顯著性差異(P>0.05)。盡管新鮮周期D6組中優質囊胚的比例低于其余3組，但差異無統計學意義(P>0.05)。無論是新鮮周期還是凍融周期，D5組平均移植胚胎數和雙囊胚移植率均顯著高于D6囊胚(P<0.05)(表2)。

表2 各組患者實驗室資料比較[(-±s)，n(%)]

三、新鮮周期與凍胚周期不同發育天數囊胚妊娠結局比較

新鮮周期中，D5囊胚的臨床妊娠率和種植率均顯著高于D6囊胚(P<0.001)，但凍融周期中D5與D6囊胚的臨床妊娠率和種植率均無顯著性差異(P>0.05)。此外，由于新鮮和凍融周期中D5組平均移植胚胎數和雙囊胚移植率較D6高，我們進一步比較了單囊胚移植和雙囊胚移植在新鮮周期和凍融周期中的妊娠結局。結果發現，新鮮周期中D6組單囊胚和雙囊胚移植的臨床妊娠率和種植率均顯著低于D5組(P<0.05)。但是在凍融周期中，無論是單囊胚移植還是雙囊胚移植，D5與D6組臨床妊娠率和種植率均無顯著差異(P>0.05)。進一步比較新鮮周期與凍融周期的妊娠結局，發現兩種周期D5組囊胚臨床妊娠率和種植率均無顯著差異(P>0.05)，但是凍融周期D6組的臨床妊娠率和種植率顯著高于新鮮周期(P<0.05)。4組間早期妊娠丟失率和異位妊娠率均無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 新鮮周期與凍胚周期不同發育天數囊胚妊娠結局比較(%)

討 論

在IVF/ICSI-ET過程中，移植的胚胎根據體外培養時間的不同，可分為卵裂期胚胎和囊胚。囊胚經過了體外初步淘汰過程，移植后較卵裂期胚胎妊娠率顯著提高[1-2]，且單囊胚移植在保證高妊娠率的前提下大大降低了多胎妊娠率[9]。近年來，囊胚移植在全世界范圍內受到了廣泛的推廣和應用。但是如何進一步提高囊胚移植的妊娠結局，仍然是生殖學者關注的熱點問題之一。

囊胚多在受精后第5天或第6天形成，因此根據發育天數不同，分為D5囊胚和D6囊胚。雖然已有不同學者對囊胚移植策略進行了分析，但是所得結果并不盡一致。Poulsen等[3]研究認為在新鮮周期中，D5囊胚比D6囊胚可以獲得更好的妊娠結局，作者將這一結果歸因于D6囊胚發育潛能受損。本研究結果與其一致，然而我們發現，當胚胎質量沒有明顯差異時，將D6囊胚行凍胚移植可以得到與D5囊胚相似的妊娠結局，這一結果與El-Toukhy等[5]研究結果一致，提示新鮮周期中D6囊胚妊娠率下降可能與內膜容受性有關。

眾所周知，胚胎植入僅能發生在月經周期特定時期，即著床窗。子宮內膜容受性受雌、孕激素的調節[10]。在IVF助孕過程中，由于超生理劑量的Gn使用、多卵泡的發育使子宮內膜暴露于高雌激素環境，內膜容受性顯著降低[11-12]。此外，在促排卵過程中，多采用大劑量HCG(5 000～10 000 U)模擬LH峰誘導卵子成熟。HCG在體內的生物活性長達5 d，可導致LH/HCG受體下調[13]。因此，子宮內膜在接受態后期可能不能對囊胚的植入產生應答。一項嚴格對照的研究比較了同一女性的非刺激周期黃體中期(LH+7)d和刺激周期黃體中期(HCG+7)d子宮內膜胚胎植入相關因子的表達變化。結果顯示大多數與胚胎植入相關的基因(包括白血病抑制因子)在刺激周期中被下調[14]。另一項研究將傳統的HCG誘發排卵與采用GnRH激動劑誘發排卵進行比較，結果發現HCG后7 d兩組子宮內膜基因表達譜存在顯著差異[15]。這些數據表明，外源性和超生理劑量性激素可能會極大地影響子宮內膜發育的時機，從而加速關閉子宮內膜的植入窗口。

與新鮮周期相反，在冷凍胚胎移植周期中，子宮內膜的最佳接受期更寬，更接近生理狀態[16-17]。在凍胚移植周期中，孕激素常用于子宮內膜的分泌轉化使其具有接受性。最近的一項臨床RCT顯示在孕酮暴露第5天和第7天進行冷凍囊胚移植的妊娠結局無顯著性差異[18]，提示在凍胚移植周期中，子宮內膜對囊胚植入的應答反應至少可持續3 d。但是遺憾的是該項研究并未比較不同發育天數囊胚的妊娠結局。在本研究中，將D5或D6冷凍囊胚復蘇后都移植到孕激素暴露第5天的子宮內膜，得到了相似的妊娠結局。提示凍融周期中，子宮內膜的囊胚植入種植窗更加靈活，但也可能與種植窗的調整有關。

本研究對新鮮周期和凍融周期不同發育天數囊胚的妊娠結局的進一步比較發現，D5囊胚在新鮮周期和凍融周期的妊娠結局并無顯著差異，但凍融周期D6囊胚臨床妊娠率和胚胎種植率顯著高于新鮮周期。但是印惠榮等[4]對新鮮周期與復蘇周期囊胚移植效果的比較研究認為凍融周期囊胚移植比新鮮周期可獲得更好的妊娠結局，并且在復蘇周期中第5天移植者比第6天移植者效果更佳。值得注意的是，該項研究中作者在進行新鮮周期和凍融周期妊娠結局比較時，并沒有對第5天和第6天囊胚進行區分，我們有理由懷疑新鮮周期較凍融周期妊娠結局差可能是由于D6囊胚妊娠率低下所致。Zeng等[19]對新鮮周期和凍融周期單囊胚移植妊娠結局的Meta分析結果亦顯示，凍融單囊胚移植并不能比新鮮囊胚移植獲得更好的結局。陳培林等[20]對不同發育天數囊胚在凍融周期的妊娠結局進行分析，認為若移植胚胎為優胚，則囊胚形成時間對于妊娠結局無顯著影響；但當移植囊胚為非優胚時，D5囊胚移植妊娠結局優于D6囊胚。由于影響妊娠結局的因素眾多，如患者年齡、卵巢儲備功能、疾病構成、宮腔環境、胚胎質量等，大部分研究者觀察D5和D6囊胚的妊娠結局時未能同時對這些因素進行比較，因此也導致了不同的研究者得出不同的結論。在本研究中，我們盡可能多的比較了各組間影響妊娠結局的相關因素，以消除這些因素對結果產生的偏倚。但是由于本研究為基于臨床數據的回顧性研究，盡管D5囊胚組的平均移植胚胎數和雙胚胎移植率高于D6囊胚組，但是種植率的比較可以部分消除這一因素的影響。此外，本研究還發現，不論新鮮周期還是凍融周期，雙囊胚移植的臨床妊娠率均高于單囊胚移植，但胚胎種植率低于單囊胚移植，這一結果為單囊胚移植的推廣應用提供了一定的依據，但其發生機制還有待進一步闡明。

綜上所述，本研究比較了新鮮周期和凍融周期D5囊胚和D6囊胚移植后的妊娠結局。結果表明，D5囊胚在新鮮周期和凍融周期移植的妊娠結局沒有顯著差異。新鮮周期中，D6囊胚移植比D5囊胚移植的臨床妊娠率和著床率更低，而凍融周期D6囊胚移植可達到與D5囊胚相似的結果，這可能與新鮮周期子宮內膜種植窗提前關閉及凍融周期種植窗的調整有關。因此，建議D6形成的囊胚應盡量避免新鮮周期移植，進行冷凍保存后擇期行凍融胚胎移植可顯著改善妊娠結局。