多囊卵巢綜合征造模藥物對大鼠內分泌和組織結構影響的初步比較

李天鶴，武香梅，劉瑞霞，陰赪宏*

(1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院 北京婦幼保健院，北京 100026；2.北京老年醫院，北京 100095)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性常見的內分泌疾病，發病率大約為5%～10%。PCOS患者常常伴隨生育力、內分泌和代謝功能的改變[1]。PCOS患者主要的臨床特征，包括排卵功能障礙、高雄激素血癥和卵巢多囊樣改變等。此外，PCOS患者主要的代謝功能異常，包括肥胖、代謝綜合征、胰島素抵抗和脂質代謝異常[2]。近年來多項研究發現，PCOS患者發生非酒精性脂肪肝疾病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)、酒精性脂肪肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH)和心血管疾病的發生率高于普通人群[3-4]。

深入研究PCOS的病因學對其診斷和治療具有重要的臨床意義，但是由于人類倫理等因素限制了PCOS病因學的研究進程，而動物模型恰好能彌補這一不足，豐富PCOS病因學的基礎研究，是PCOS發病機制研究過程中不可或缺的重要手段。自1960年起，陸續出現了獼猴、山羊和嚙齒類動物的PCOS模型，其中在產前暴露于雄激素的山羊和非人類靈長類動物可以很好地模擬人類的PCOS表型[5-7]。山羊和獼猴產前暴露于雄激素均可以出現寡排卵或無排卵、卵巢多囊樣改變、LH超分泌以及胰島素抵抗等癥狀[8]。由于嚙齒類動物的飼養成本低、繁殖較快，易于基因編輯，因此，目前多采用嚙齒類動物作為模型研究PCOS的發病機制。目前文獻中的嚙齒類PCOS動物模型通常利用雄激素、雌激素、芳香酶抑制劑、抗孕激素以及改變光照等手段進行PCOS模型的構建。不同造模藥物對大鼠內分泌和糖脂代謝的影響不同。

目前缺少PCOS動物模型相關的標準，以及對多種PCOS模型大鼠內分泌、糖脂代謝的綜合比較。此外，關于多種PCOS動物模型中主要組織器官結構變化也鮮有報道。因此，本研究利用脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)、雙氫睪酮(Potent Non-aromatizable Androgen，DHT)和來曲唑(Letrozole，LET)這3種藥物分別構建PCOS大鼠模型，通過分析各模型構建藥物組大鼠內分泌代謝水平、各組織器官結構變化，初步了解不同造模藥物在PCOS大鼠模型構建過程中的作用，為今后PCOS疾病的研究提供一定參考。

材料和方法

一、實驗材料

1.實驗動物：3～4周齡SD雌性大鼠(SCXK(京)2016-0002)購買并飼養在譜尼測試集團股份有限公司，SPF級屏障系統，飼養溫度為24～26℃，濕度為50%～70%，光照黑暗時間比為12 h/12 h，自由飲水取食。本實驗中動物的使用已獲得中國科學院大學實驗動物使用與管理委員會批準。所有動物實驗操作過程符合NIH規定的實驗動物福利和道德規定。

2.主要實驗試劑及儀器：DHEA(D8950，北京索萊寶科技)；DHT(S4757，Selleck，美國)；LET(L6545，Sigma，美國)；睪酮(T，MC12987)、雌二醇(E2，MC12312)、LH(MC12403)、FSH(MC12313)、胰島素(Insulin，INS，MC12996)和ELISA檢測試劑盒等均購買于北京美辰聯創生物科技有限公司；甲醇(北京化工廠)；瑞氏染色液(SL7030，北京酷來博科技)；4%多聚甲醛(G1101，武漢賽維爾生物科技)；顯微鏡(CKX41，Olympus，日本)。

二、實驗方法

1.實驗分組：選取3～4周齡SD大鼠40只，隨機分為正常對照組、脫氫表雄酮(DHEA)組、雙氫睪酮(DHT)組、和來曲唑(LET)組，分別給予皮下注射注射用油劑、6 mg/100 g DHEA[9]、85 μg DHT[10]、1 mg/kg LET[11]，每天1次，連續注射21 d。造模第22天，將大鼠分為2部分，一部分用于取材(每組6只)，一部分進行動情周期觀察(每組4只)。

2.取材：大鼠造模第22天，用消毒的注射器從大鼠眼球取血并分離血清待測。大鼠斷頸處死，將新鮮心、肝、脾、肺、腎和卵巢組織固定于4%多聚甲醛，24 h后用于HE染色。

3.體重的測定：每7 d稱量大鼠體重。造模第22天，大鼠斷頸處死分離心、肝、脾、肺、腎和卵巢組織并稱重。

4.大鼠動情周期觀察：從大鼠給藥第22天開始，每天上午10：00用無菌棉簽浸泡在0.9%的生理鹽水中，沿陰道璧的前1/3處涂抹并沿同一方向涂抹到玻片上，用無水甲醇固定陰道脫落細胞5～8 min，滴加2～3滴瑞氏染色液染色3 min，滴加等量磷酸鹽緩沖液，輕晃玻片至均勻，靜置5 min，水洗至少3 min，待自然干燥或吸干，鏡檢[12]，連續10 d，并繪制動情周期曲線。動情前期涂片特征：以小、圓、有核上皮細胞(鱗狀上皮細胞)存在為特征；動情期：以不規則(角質化)的鱗狀上皮細胞為特征；動情后期：以白細胞和角質化細胞為特征；動情間期：白細胞和圓上皮細胞出現為特征。大鼠失去規律的動情周期，或持續處于動情間期，則提示無排卵。

5.大鼠血清激素水平檢測：取各組血清按照ELISA試劑盒說明書檢測T、E2、LH和FSH含量，用酶標儀(Spark 10M，Tecan，Switzerland)于波長450 nm下檢測其OD值。

6.大鼠血清生化檢測：使用全自動生化分析儀Olympus AU400(Olympus，日本)檢測各組大鼠血清中總膽固醇(Total Cholesterol，TCHO)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、葡萄糖(Glucose，GLU)和INS含量。穩態胰島素評價指數(HOMA-IR)是用于評價個體的INS抵抗水平的指標，HOMA-IR=空腹血糖水平×空腹胰島素水平/22.5。

7. HE染色：將取到的心、肝、脾、肺、腎和卵巢等組織固定于4%多聚甲醛24 h后，常規石蠟包埋切片，HE染色后在顯微鏡下觀察，記錄染色結果。每次實驗中每組選取3～4只大鼠，每次實驗任意選取3～4張切片。

三、統計學方法

結 果

一、大鼠血清中激素水平測定

與對照組相比，DHEA組血清T、E2水平顯著升高(P<0.05)，而血清LH、FSH水平無統計學差異(P>0.05)；與對照組相比，DHT組血清E2、LH水平顯著升高(P<0.05)，血清T、FSH水平無統計學差異(P>0.05)；與對照組相比，LET組血清T、LH水平顯著升高(P<0.05)，血清E2水平顯著降低(P<0.05)，而FSH水平無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清激素水平比較(-±s)

二、動情周期的檢測

經過連續10 d的涂片及鏡下觀察發現，各組動情周期變化如圖1所示。與對照組相比，3種建模藥物組均無明顯的大鼠動情周期變化，持續處于動情間期，提示無排卵，其中DHEA組處于動情間期時間最長。

A：對照組；B：DHEA組；C：DHT組；D：LET組；P：動情前期；E：動情期；M/D：動情后期/間期圖1 各組大鼠動情周期曲線

三、卵巢病理學改變

HE染色結果顯示，3種建模藥物均能引起卵巢組織發生囊樣改變(箭頭所示)，其中DHEA組大鼠卵巢多囊樣改變最為顯著(圖2)。

四、各組大鼠糖脂水平比較

與對照組相比，DHEA組TCHO、INS水平及HOMA-IR顯著增高(P<0.05)，TG、GLU水平無統計學差異(P>0.05)；與對照組相比，DHT組TCHO、INS、TG、GLU水平及HOMA-IR均無統計學差異(P>0.05)；與對照組相比，LET組TCHO、TG、GLU水平均無統計學差異(P>0.05)，INS水平及HOMA-IR顯著增高(P<0.05)(表2)。

五、大鼠體重及各組織重量的變化情況比較

與對照組相比，DHEA組、DHT組大鼠體重變化無統計學差異(P>0.05)，而LET組大鼠體重顯著升高(P<0.05)(圖3A)。造模第21天，與對照組相比，DHEA組大鼠心臟/體重比、肝臟/體重比顯著增加(P<0.05)，而卵巢/體重比顯著下降(P<0.05)，脾、肺和腎/體重比無統計學差異(P>0.05)；與對照組相比，DHT組和LET組大鼠的心、肝、脾、肺、腎和卵巢組織重量/體重比均無統計學差異(P>0.05)(圖3B)。

A：對照組；B：DHEA組；C：DHT組；D：LET組；箭頭示囊樣改變圖2 各組大鼠卵巢結構(HE染色 ×40)

表2 各組大鼠血清中糖脂含量比較(-±s)

A：體重的變化；B：各組織器官重量的變化；與對照組比較，*P<0.05圖3 各組大鼠體重及各組織重量的變化情況

六、各組大鼠主要組織器官結構的變化情況

對照組和DHEA組中大鼠心臟組織中的心肌細胞呈不規則形，核卵圓形，細胞核1～2個，位于細胞中央；DHT組和LET組大鼠心臟組織中的局灶細胞間可見少量淋巴細胞浸潤。

對照組和DHT組大鼠肺臟組織中肺泡結構尚在，部分肺泡腔輕度塌陷，肺泡間隔增寬，間質內可見少許淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤；DHEA組大鼠大部分肺泡腔輕度塌陷，間質內可見少許淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤；LET組大鼠大部分肺泡間隔增寬，支氣管周圍淋巴組織增生。

各組大鼠的脾臟組織中，紅髓和白髓結構清晰，脾小結生發中心明顯，邊緣帶清晰可見，脾索及脾竇結構清晰，與對照組比較，DHEA組大鼠脾小結生發中心不明顯，局部伴纖維組織增生(圖4)。

圖4 各組大鼠主要器官組織結構(HE染色 ×100)

討 論

本研究建立并比較了3種PCOS造模藥物對大鼠內分泌和各組織器官結構的影響。我們的研究結果顯示，DHEA、DHT和LET 3種建模藥物對大鼠血清激素水平、體重以及各組織器官結構等方面的作用各不相同，為今后構建PCOS動物模型提供一定參考。

高雄激素血癥是PCOS臨床診斷標準之一。大鼠孕期DHT短期處理可以顯著上調雄激素水平[13]，而本研究中，DHT處理育齡期大鼠 21 d后，大鼠PCOS表型不明顯，T未出現升高趨勢，E2和LH水平顯著增加，卵巢組織出現多囊改變，這可能與藥物處理時間的長短和處理方式有關系。DHEA處理可以上調大鼠血清中E2和T水平。而LET處理上調了LH水平，下調E2水平。因此，可以看出3種不同PCOS造模藥物，對大鼠性激素的調控作用不同。此外，3種PCOS模型藥物均可以誘導大鼠動情周期失調，可能與雄激素暴露有關。產后暴露于丙酸睪酮(Testosterone Propionate，TP)、產前暴露于DHT、長期暴露于DHT均可以導致大鼠排卵功能障礙，而DHEA處理大鼠可以導致生殖障礙[14-16]。

除性激素水平的改變外，肥胖和胰島素抵抗也是PCOS的重要臨床表現之一[17]。在模型構建期間，與對照組比較，DHEA組和DHT組大鼠體重無顯著變化，但是DHEA組大鼠血清中TCHO含量顯著增加(P<0.05)，并表現出胰島素抵抗癥狀。在造模第21天，LET組大鼠體重顯著高于對照組(P<0.05)，并表現出胰島素抵抗，這可能與性激素水平有關[18-19]。因此，DHEA和LET誘導的PCOS動物模型可能更加適用于進行糖脂代謝相關方面的研究。

PCOS可以導致慢性無排卵、高雄激素血癥、不孕和肥胖等疾病，增加NAFLD、NASH和心血管疾病的發生風險[20-21]。其中雄激素發揮了重要作用，長期T處理可以導致大鼠體重增加，導致胰島素抵抗，進一步引起肝損傷[22]。利用DHEA處理大鼠21 d，誘導胰島素抵抗發生，從而促進肝臟脂質沉積[23]。此外，雄激素對炎癥的調控具有細胞特異性。DHT重建減少了過敏性肺炎癥小鼠的肺部炎癥，但它增強了肺泡巨噬細胞的M2極化。在體外也能增強IL-4刺激的M2巨噬細胞極化[24]。DHT組和LET組大鼠心臟組織中的局灶細胞間可見少量淋巴細胞浸潤；DHEA處理可導致大鼠肺泡腔輕度塌陷，以及少許淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤；此外，DHEA處理大鼠，可導致脾臟組織中脾小結生發中心不明顯，局部伴纖維組織增生；LET處理可導致大鼠肺泡間隔增寬，支氣管周圍淋巴組織增生。可見，除誘導PCOS表型外，DHEA、DHT和LET還可對大鼠的部分組織和器官的結構造成影響。