植物免疫誘抗劑的發現、作用及其在農業中的應用

2020-12-22 12:31:33王露露岳英哲孔曉穎張曉英路沖沖丁新華

世界農藥 2020年10期

王露露，岳英哲，孔曉穎，張建，張曉英，李洋，孔波，路沖沖，李洋，丁新華

(1.山東農業大學植物保護學院，泰安 271018 ；2. 山東蓬勃生物科技有限公司，泰安 271018)

植物病蟲害的化學防治是我國糧食產量和品質的保障，但是化學農藥的過度使用給環境和人類健康造成嚴重損害。2015年農業部提出化肥農藥零增長計劃，因此開發生物農藥是解決農藥污染問題，實現農藥減量的有效手段之一。植物免疫誘抗劑作為新型生物農藥，并不能直接對病原菌進行強烈的毒殺，而是以植物為目標，通過調節植物本身的免疫、代謝系統來增強植物對病原菌的抗性，提高植物抗逆性，促進植物生長。植物免疫誘抗劑作為植物保護的新實踐，因具有對人畜毒性低，環境相容性高，作用譜廣，病原菌不會產生抗藥性等優點而獲得關注，在農業生產中應用越來越廣泛。

1 植物免疫誘抗劑的定義及發展歷程

植物免疫誘抗劑即植物疫苗，主要通過增強植物生理功能，增加植物對致病因子的抵抗力，從而提高植物的誘導抗性[1]。它能夠激發植物體內多條代謝路徑，加強新陳代謝，促進植物的生長發育，達到增產抗病的效果。植物免疫誘抗劑也稱為植物生物刺激素，歐盟管理法規對植物生物刺激素的定義為：一種刺激植物營養過程的產品，其目的是改善植物的一個或多個特性如營養素利用效率、對非生物脅迫的耐受性、土壤和根際中作物質量特性或限制營養素的有效性[2]。

1933年蘇聯Filatov教授首次討論“生物刺激”理論，植物在外界不利但不致命的條件下，會經過生化重組形成非特異性的生物刺激物，激發生物體反應，抵抗病原菌的入侵，增強植物免疫力[3-5]。Herve為生物刺激素提供了第一個真正的概念性產生方法，指出生物刺激素的開發應該建立在化學合成、生物化學和生物技術的系統方法的基礎上，能夠在低劑量下發揮作用，并且對生態友好[6]。1992年，美國學者從淀粉歐文氏菌中分離出一種引起植物防御反應的蛋白質激發子，該激發子被命名為Harpin，能誘導煙草等植物產生過敏反應[7]。Zhang和Schmidt在1999年強調了對生物刺激素進行全面和實證分析的必要性，特別強調生物刺激作用是通過激素效應，其次是通過抗氧化劑對非生物脅迫的保護。它的作用主要表現在提高光合作用效率，減少病原菌的強度及傳播，并提高作物產量[8]。Basak開創了對生物刺激素的系統討論，為現代生物刺激素科學的形成創造了概念前提[9]；Du Jardin首次對植物生物刺激素科學進行了深入的分析，強調了生物刺激素在生理生化功能、作用方式和來源上的系統化和分類。該分析和分類對歐盟后續立法和法規的發展產生了重要影響[10]。2012年11月在斯特拉斯堡召開的第一屆世界生物刺激素農業大會被視為接受生物刺激素進入學術界的一個里程碑。2014年美國科學家指出生物控制微生物和植物生長促進微生物可以促進植物生長發育以及誘導植物系統獲得抗性，提高植物對生物和非生物脅迫的耐受性[11]。植物在抵抗病原菌時會產生一系列信號物質如水楊酸、乙烯、茉莉酸和脫落酸等進行信號傳導，誘導植物抗病相關基因表達，這些信號物質也可以作為植物免疫誘抗劑的原材料[12]。

2 植物免疫系統

植物免疫誘抗劑作用于植物本身，通過預先激活植物自身免疫系統來抵御病原菌的入侵，從而達到促進植物抗病的目的。植物在生長過程中不斷地受到病原菌的侵染，為了抵抗病原菌侵入，植物有兩種信號防御機制，包括病原相關分子觸發免疫(PAMP-triggered immunity, PTI)以及效應分子觸發免疫(Effector-triggered immunity, ETI)。植物免疫的第一類受體——模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)定位于細胞膜上，其胞外結構域可以特異性識別病原相關分子模式，再通過跨膜結構域激活胞內激酶結構域，進而激活免疫反應[13-14]，如植物FLS2對細菌鞭毛蛋白flg22的識別、EFR對細菌延伸因子Tu的識別等[15-16]。PTI主要在病原菌侵染初期起作用，具有非寄主抗性，可以通過鈣離子內流、胼胝質沉積、活性氧爆發、氣孔關閉，產生一氧化氮及水楊酸、茉莉酸等多種植物激素來抵抗病原菌[17]。面對植物的抗御策略，病原菌進而分泌效應因子(Effector)抑制植物 PTI。為與病原菌抗衡，植物進化出防御效應因子的第二類免疫受體NLR (Nucleotide-binding leucine-rich repeat)即 ETI。相較于PTI，ETI激活的下游免疫反應強度更大，時間更長，并且一般會伴隨著程序性細胞死亡，導致過敏反應[18]。病原菌會繼續通過效應因子的變異來入侵植物，二者在斗爭中共同進化[19]。

3 植物免疫誘抗劑的種類

能夠激活植物產生免疫反應的物質稱為激發子，主要包括蛋白類、寡糖類、脂類、小分子代謝物類、水楊酸及其類似物等類型[20]。蛋白質激發子是目前已鑒定種類最多的激發子類型，已鑒定出壞死及乙烯誘導相關蛋白(Nep1-like protein)、過敏反應誘導蛋白(Hrip)、纖維素酶(Cellulase)等幾十種免疫激活蛋白[21-23]，這為后續植物免疫誘抗劑的研究積累了重要的蛋白資源。BcGs1是來源于灰霉病病菌(Botrytis Cinerea)的一種細胞壁降解酶，它可以觸發植物的免疫反應，抵抗病原菌侵襲植物。研究表明，BcGs1通過活性氧代謝和苯丙烷代謝誘導番茄的防御反應，可以引起活性氧爆發，提高苯丙胺酸解氨酶和過氧化物酶活性，促進木質素積累，提高番茄對灰霉病的抗性[24]。XEG1是從大豆疫霉中發現的GH12家族糖基水解酶，可以誘導植物產生免疫反應，如活性氧爆發、胼胝質沉積、抗病相關基因的高表達以及過敏性壞死反應。植物細胞膜上的共受體蛋白BAK1可以識別XEG1，并與其他受體蛋白互作誘導植物免疫。進一步研究發現XEG1的特異性受體 RXEG1，二者結合激活免疫通路[25]。XEG1是植物、疫霉菌、真菌、細菌中廣泛存在的植物免疫激發子[26]。寡糖類激發子在自然界中含量豐富，主要通過誘導植物的系統抗病性來增強植物抵抗病原菌的能力。海帶多糖是從褐藻海帶中提取的β-1,3-葡聚糖，是植物防御反應的激發子，主要通過鈣離子內流、活性氧爆發、抗病相關基因表達、絲裂原活化蛋白激酶的激活、幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的增加、植物防御素的產生等免疫反應抑制葡萄灰霉病病菌侵染葡萄[27]。海藻糖是一種非還原性雙糖，廣泛存在于包括真菌在內的多種生物中。在噴灑海藻糖溶液后，小麥被白粉病侵染程度降低。研究表明，海藻糖不僅可以抑制分生孢子萌發和附著體分化，還可以提高苯丙氨酸解氨酶和過氧化物酶的活性[28]。幾丁質是一種N-乙酰葡糖通過β連接聚合而成的多糖，主要存在于真菌的細胞壁上[29-30]。幾丁質可以與擬南芥和水稻激酶活性共受體 CERK1結合，引起植物免疫反應。CERK1參與細菌肽聚糖和脂多糖引發的免疫信號轉導、真菌β-1,3-葡聚糖引發的免疫信號轉導和短鏈幾丁質寡糖引發的共生信號轉導、細胞死亡以及植物耐鹽等生理活動[31]。脂多糖是脂類激發子的一種，由革蘭氏陰性菌產生，通過微生物相關分子模式的感知觸發植物的先天免疫。從擬南芥中鑒定到脂多糖的受體蛋白為凝集素-S-結構域-類受體激酶LORE，LORE在煙草瞬時表達后賦予煙草對脂多糖的敏感性，這在脂多糖傳感中發揮了關鍵作用，并表明了在作物物種中進行工程抗病的可能性[32]。水楊酸(Salicylic acid, SA)調節植物生長發育的多個方面，并激活植物對生物和非生物脅迫的防御，是植物對多種病原菌產生抗性所必須的一種關鍵物質。1979年SA與植物免疫的關系被首次提出，乙酰水楊酸能使感病煙草對煙草花葉病毒產生抗性[33]。SA可以被兩種不同的受體——NPR1和NPR3/NPR4感知，SA結合刺激NPR1的轉錄激活活性，抑制NPR3/NPR4的轉錄抑制活性，誘導產生防御相關基因[34]。SA處理還可以誘導一些感受器NLRs和大多數已知的NLR信號轉導元件的表達，增強PRR和NLR介導的免疫反應[35]。SA在植物抗病方面具有良好效果，外源施用 SA可提高甜瓜中總酚、類黃酮、木質素含量以及增強抗病相關酶活性，延遲甜瓜發病時間，降低發病率[36]。水楊酸還可誘導黃瓜對白粉病的抗性[37]。此外，SA可以提高植物抗逆性，SA處理鹽脅迫下辣椒幼苗可提高其葉綠素含量，使其恢復正常生長[38]。SA對寒冷脅迫下的小麥、番茄也有一定的緩解和恢復作用[39-40]。

4 植物免疫誘抗劑及其制劑產品在農業中的應用

傳統的殺菌劑、化肥主要以病原菌及特定的營養需求為靶點，對農作物進行病害防治和產量提高，而忽略了植物本身對生物和非生物脅迫的抵抗能力。當前，植物免疫誘抗劑主要以外源生物或分子激活植物體內的免疫系統，提高植物抗病力，此外還激發植物代謝系統，促進植物根莖葉的生長及葉綠素的合成，提高作物產量，在農業生產中有良好的應用效果。目前植物免疫誘抗劑主要有植物免疫蛋白、寡糖、水楊酸及其類似物、次生代謝物等類型。

植物免疫蛋白是一種新型生物農藥，在抗病、增產、抗凍、提高品質等方面具有良好效果，通過信號傳導系統誘導植物抗病相關基因的表達，進而促進防御物質的產生，提高植物免疫力，減輕病害的發生。邱德文團隊從極細鏈格孢菌中分離純化得到高活性蛋白并加入氨基寡糖素制成世界上首個植物免疫蛋白生物農藥 6%寡糖·鏈蛋白質可濕性粉劑(阿泰靈)[41-42]。阿泰靈能夠促進植物根系生長，增強植物免疫，達到防治病害的效果。研究表明，阿泰靈能使小麥、水稻等糧食作物、茶葉、大姜等經濟作物以及番茄等蔬菜增產 5%～10%[43]，并且對番茄黃化曲葉病毒病、煙草花葉病毒病、水稻紋枯病等具有明顯的防治效果[44-46]。植物免疫增產蛋白對生姜、芝麻、蓮藕、水稻等作物具有增產提質的效

果[47-50]。

美國生物公司的新型生物農藥 Messenger是含Hapin蛋白的可濕性顆粒劑。Harpins是革蘭氏陰性菌在病原菌-植物相互作用過程中 III型分泌系統分泌的蛋白質，可以作為激發子，刺激多種非寄主植物的防御和植物生長[51]。Harpin處理的植株具有更高的抗性、品質和產量，因此Harpin蛋白可能具有許多潛在的農業應用價值。從木薯枯萎病菌中鑒定出一個新的 Harpin-HpaXpm，可有效地誘導非寄主植物的過敏性反應、防御反應和促進生長[52]。Harpin蛋白 Hpa1能夠顯著誘導防御相關酶活性并增強抗病相關基因表達，增加過氧化氫、胼胝質等抗病相關物質含量，對煙草花葉病毒有很好的防御效果[53]。

氨基寡糖素也稱為農業專用殼寡糖，是植物識別病原真菌入侵的非特異性信號，對許多植物顯示出強烈的免疫誘導活性，可以激發植物的基因表達，產生抗病的甲殼素酶、殼聚糖酶、植保素和免疫蛋白，這些物質能抑制病菌生長和殺滅病菌，達到抗病目的[54]。中國農藥信息網公開數據顯示，截至2020年9月我國登記氨基糖糖素農藥產品76個，水劑為氨基寡糖素的主要劑型。氨基寡糖素應用前景廣闊，對促進農作物增產抗病，推進我國農業可持續發展具有重要的意義。不同濃度的殼寡糖基聚合物可作為保鮮劑，對成熟度80%的紫花芒進行果面噴施后，發現1%～2%的殼寡糖基聚合物水溶液對芒果具有很好的保鮮效果，且芒果的可溶性固形物、維生素 C、可滴定酸含量等指標和好果率、失重率均明顯優于對照[55]。受凍的黃瓜經殼寡糖處理后，其長勢明顯好于對照，處理過的植株果實采收期可比對照提前3～5 d，產量也明顯高于對照[56]。葉片噴施殼寡糖對茶樹有較好抗病增產效應[57]，同時發現殼寡糖在葉片培養基中可起到激素的作用，對培養基及外植體起到了防污抗病的保護作用[58]。

褐藻寡糖(Alginate-derived Oligosaccharide, AOS)是由褐藻膠降解而來，可作為植物激發子，促進植物生長，增加產量，提高品質，增強植物抗逆性和抗病性。研究表明，適當濃度的AOS可以增加黃瓜幼苗的株高、莖粗和鮮重以及光合能力，促進植株生長。此外，AOS還可促進黃瓜體內抗氧化酶活性，消除過多的活性氧，增強植物抗逆能力[59]。在干旱脅迫下，AOS對黃瓜的促生和抗逆效果更明顯，主要是 AOS通過刺激脫落酸的合成提高了黃瓜的抗旱性[60]。AOS可以通過誘導次生代謝和調節防御相關酶的活性提高草莓對白粉病菌的抵抗力[61]。此外，褐藻寡糖在食品開發、藥物研制、疾病預防等方面也具有良好的研究進展。

康而健是從抗病植物中提取的富含水楊酸及其衍生物的綜合性免疫誘抗劑，可以激發植物抗體，對細菌性、真菌性及病毒性病害均具有免疫作用，可以預防植物病害的發生，減輕病害造成的損失。此外，康而健內吸性強，可直接進入植物細胞內，快速穩定地激發植物產生抗體，誘導植物產生抗性反應，提高對病原菌的抗侵染能力[62]。對離體葡萄葉片噴施康而健1 000倍溶液，能夠延緩并減輕葡萄葉片霜霉病的發生，抑制病斑擴散。在葡萄開花前噴施康而健，對葡萄灰霉病、霜霉病、白粉病等均有較好的預防效果，且葡萄葉片厚綠，落果減少。此外，在辣椒疫病發病前噴施康而健700倍溶液，10 d后，與對照組相比，處理后的辣椒疫病發病率減少近50%，康而健有效地降低了辣椒疫病的發生程度。瑞士先正達公司的植物免疫誘抗劑 Actigard是以苯丙噻二唑(2,1,3-benzothiadiazole, BTH)為活性成分，BTH是水楊酸結構類似物，對植物有良好的誘導免疫活性，對細菌、真菌和病毒性病害具有很好的防治效果。BTH可誘導辣椒對白粉病產生抗性，BTH處理辣椒后會使辣椒葉片中過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙酸解氨酶活性明顯增加，并抑制白粉病病菌菌絲生長[63]。

智能聰(ZNC)是野生沙棘內生真菌的提取物，該內生真菌被鑒定為宛氏擬青霉(Paecilomyces Variotii)菌株SJ1。其具有促進植物生長，提高作物產量和抗逆性的作用，在我國農業生產中被廣泛應用。ZNC作為一種激發子，可以通過促進氮磷吸收和轉運以及生長素的合成等促進植物生長，同時，通過活性氧爆發、胼胝質沉積、抗病相關基因上調、激活SA生物合成及信號通路等途徑提高植物防御病原菌的能力[64]。此外，ZNC對植物病毒有一定的預防和治療作用，主要通過PAL基因的表達誘導水楊酸的生物合成，促進 RNA沉默來抵抗病毒侵染[65]。ZNC可以通過提高植物體內超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和苯丙氨酸解氨酶活性，降低Na+/K+和丙二醛含量，提高植物對非生物脅迫(抗鹽、抗低溫)的抗性[66-67]。ZNC可作為一種痕量營養增效物質用于控釋尿素，可提高氮肥利用率15%～20%，提高水稻產量10%[68]；與常規磷酸二銨復配后可有效促進玉米根系生長，增強根系活力，根表面積增加80%，土壤有效磷含量提高45%，提高玉米產量[69]。對不同作物施用 ZNC后發現，ZNC具有促進種子萌發、根系發育、生殖發育以及抗病抗逆的能力，對小麥、馬鈴薯、葡萄、黃瓜、茄子、煙草等多種作物均有顯著效果[70]。ZNC作用快速，在接觸植物2 h內就能激發植物體內抗性基因上調表達，在田間使用5 d左右就有較明顯的田間表現；具有超高活性，在1 ng/mL(十億分之一)時即具有顯著功效，并且在低濃度表現促生及抗逆效果，在高濃度抗病能力增強，其活性為腐植酸鈉的30 000倍，海藻酸的300 000倍[71]，因此ZNC具有極高的科研價值及田間應用推廣價值。

5 展望

在傳統認知中，植物在遭遇病蟲害攻擊時一定要使用化學農藥進行直接防治，這樣雖快速有效，但長期使用，不僅會使病蟲害產生抗性，而且對生態環境造成嚴重影響。與傳統化學農藥相比，植物免疫誘抗劑存在許多優點，如對環境友好，對人畜毒性較低，不會導致病原菌產生抗藥性，使用濃度低，作用范圍廣等。植物免疫誘抗劑以預防為主、治療為輔，通過提高植物抗病性，減輕病害發生，符合綠色、高效、低污染的農藥行業發展方向。