雷公山自然保護區搖蚊科的物種鑒定

余海軍 王乙婷 黃鑫 邰春青 鄭慧芳 王茜

摘要：基于DNA條形碼和形態學對雷公山自然保護區的搖蚊類群進行物種鑒定。結果表明，自然保護區內的搖蚊類群共計4亞科12屬18種，并對其中的12屬特征進行補充描述，附18種搖蚊成蟲的整體標本圖;通過DNA條形碼分析得到18個mOTU（ Molecular operational taxonomic unit），與形態學結果一致。

關鍵詞：搖蚊科;DNA條形碼;物種鑒定;雷公山自然保護區

中圖分類號：S931.1

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114[ 2020） 20-0083-05

D01：10.1408 8/j .cnki.issn043 9- 8114.2020.20.018

雷公山自然保護區（國家級保護區）位于貴州省東南部，地跨雷山、臺江、劍河、榕江四縣，面積達47 300 hm2。雷公山自然保護區屬于長江水系和珠江水系的分水嶺地帶，是構成清水江和都柳江主要支流的發源地…。自然保護區由于氣候溫暖，生境復雜，為昆蟲物種提供了優良的棲息環境，從而保護區內的昆蟲物種資源一直較為豐富。2011年的研究調查顯示，雷公山自然保護區昆蟲有22目194科1 114屬1 861種，其中，雙翅目14科89屬261種[2]。

搖蚊（ Chironomidae）隸屬于雙翅目長角亞目（ Diptera：Nematocera），全世界已記述的種類超過6 359種[3]。搖蚊廣布于各種水體中，是種類最多、分布最廣的淡水底棲動物類群之一[4];由于搖蚊的遷移能力相對較弱，不同種屬之間的生態要求和生活習性多種多樣，不同類群對生存環境適應變化有較大的差異，從而使得它們成為水環境生物監測的優良指示物。

截至2001年，國內有關搖蚊研究的論文達200余篇[5]。DNA條形碼問世后[6]，學者將其結合傳統形態學廣泛用于搖蚊的研究，取得了較大的成果，特別是在江浙一帶，關于搖蚊研究的報道層出不窮[7-13]。雷公山自然保護區的地質結構復雜，巖石層中富含獨特的化學物質和生命營養物質，是生命科學和地球科學之間微觀聯系的地區[2]。李小海等[14]2014年在雷公山自然保護區發現昆蟲3種新紀錄種，即鱗翅目1種，鞘翅目2種;付梓源等[15]2015年通過對雷公山自然保護區進行生物調查，記述昆蟲15種，即半翅目1種，鱗翅目4種，鞘翅目10種;但迄今為止，該地區關于雙翅目的報道，尤其是搖蚊物種的報道較為鮮見。本研究通過DNA條形碼和形態學對自然保護區內的搖蚊進行研究，目的是為中國DNA條形碼數據庫提供有效數據，以及提供基礎數據用于今后雷公山自然保護區的生態環境研究和生物多樣性評估。

1 材料與方法

1.1 標本制作及鑒定

所用標本均來自于2019年8月21日至10月7日貴州省黔東南州雷山縣雷公山自然保護區。樣本保存于85%乙醇，標本照片采用智能數字立體解剖鏡進行整體照。并在體視鏡下解剖為頭、胸、足、翅、腹部5個部分，頭、胸部留取用作DNA提取，其余部分用Eurpal樹膠封片，DNA提取后頭、胸部相繼封存于相應的玻片上作為證據標本。形態鑒定特征術語采用文獻[16]的描述方法，特征的測量參考李麗梅[17]的研究方法;證據標本均保存于天津農學院水產遺傳育種實驗室。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

基因組DNA提取采用Qiagen DNA Blood andTissue kit試劑盒，并按照試劑盒說明書提取。使用通用引物LC01490和HC02198[18]擴增COI條形碼。PCR擴增反應體系為25.000 μL.包含12.500 μL 2xEs Taq MasterMix（ CoWin Biotech Co， Beijing， China），上、下游引物各0.625 μL，無菌水8.750 μL，DNA模板2.500 μL。通過Mastercycler Gradient進行擴增，擴增程序為：預變性98℃10 s，94℃5 min;94℃1 min，51℃1 rriin.72℃1 min，35個循環;最后延伸72℃5 min;10℃保存。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行純化測序。

1.3 數據處理

根據測序公司返回的序列導人Seqman（ DNA-STAR，Madison，USA）中進行編輯[7]。序列通過MEGA 7.0軟件使用MUSCLE算法進行比對，并對序列特征及各堿基含量進行統計;使用Kimura-2-parameter （K2P）堿基替換模型計算各序列之間的遺傳距離;選用K2P堿基進化模型，節點處置信度為1 000，其他設置均為默認值，建立NJ （Neighbor-joining）樹。

2 結果與分析

2.1 DNA條形碼分析結果

采用DNA條形碼分析中最常用的NJ法，該法基于遺傳距離和最小進化原理，通過自舉檢驗法進行聚類，并通過統計給定樹分支的可信度，得出最優樹[19]。在NJ樹中，基于27條DNA條形碼明顯分離出18個mOTU，代表搖蚊科中已命名的物種，該結果顯示DNA條形碼的鑒別結果與形態學鑒定結果一致，如圖1所示。同時，研究所用的27條DNA序列及其相關信息均已上傳Barcode of Life Data System（ BOID，http：//www. boldsystems.org）數據庫的公開Project“HJB”。

2.2保護區搖蚊種類記述

本研究記述雷公山自然保護區搖蚊物種共4亞科12屬18種，基于Wiederholm[20]對搖蚊科物種形態學的描述，對其中12屬的主要特征進行補充描述，并提供18種的標本整體照。

2.2.1 搖蚊亞科（Chironominae） Macquart

1）搖蚊屬（Chironomus Meigen）。主要特征：體型中到大型。體色綠或淡棕黃色，觸角11節，觸角比（AR）遠大于2.0;翅膜質部分沒有剛毛，有明顯刻點，花翅搖蚊（Chironomus kiiensis）翅上有明顯的翅斑，臀角具剛毛，R、R1、R4+5有剛毛，腋瓣具有緣毛。中后足脛節具有排列緊密的脛櫛，有強壯的脛距，偽脛距存在或者缺失。腹部背板有分散或密集的剛毛。肛尖端部膨大;上附器細長，末端鉤狀;下附器棒狀，末端靠近抱器端節中部。

世界廣布，中國記錄24種，本研究記述2種，分別為黃羽搖蚊（Chironomusflaviplumus）（圖2A）、花翅搖蚊（圖2B）。

2）多足搖蚊屬（Polypedilum Kieffer）。主要特征：體小型到大型。體色淡黃、棕黃或黑色，翅具翅斑或呈褐色，足有時具各種黑色環。觸角鞭節13節，觸角比0.60-3.50;R、R1、R4+5有剛毛。肛尖細長。上附器細長多變，基部具長毛和微毛;中附器缺失;下附器棒狀，抱器端節形狀和長度多變，與抱器基節相連處窄。

世界廣布，中國記錄62種，本研究記述6種，分別為源平多足搖蚊（Polypedilum genpeiense）（圖2C）、淺川多足搖蚊（Polypedilum asakawaense（圖2D）、加茂三多足搖蚊（Polypedilum kamotertium）（圖2E）、陽山多足搖蚊（Polypedilum yougsanensis）（圖2F）、仙居多足搖蚊（Polypedilum xianjuensis）（圖2G）、刀鋏多足搖蚊（Polypedilum cultellatum）（圖2H）。

3）擬搖蚊屬（Parachironomus Lenz）。主要特征：體中到大型，翅長2.00-4.50 mm;體黃或棕色，色斑棕色或黑色，部分種類足和腹部具色帶。觸角11節，觸角比1.50-3.30。翅膜區無毛，少數具頂剛毛，腋瓣具較多緣毛。生殖節第九背板后緣形態多變，鍥形，圓形，或明顯形成側翼。肛尖細長;上附器長短不一，頂端常具喙狀側突，端部具剛毛，生于凹陷處;下附器葉狀突起有時退化。抱器端節與基節愈合，形狀多樣。

世界廣布，中國記錄13種，本研究記述1種，為細突擬搖蚊（Parachironomus exilisus）（圖21）。

4）明搖蚊屬（Phaenopsectra Kieffer）。主要特征：體中到大型，翅長2.08-3.00 mm;體棕色;足淺黃色;觸角13節，觸角比1.00-3.00;翅膜區具斑點和少量剛毛，腋瓣具短緣毛;生殖節第IX背板中部具剛毛;肛尖細長，端部略膨大;上附器細長，端部鉤狀，基部具剛毛;下附器指狀或棒狀，常密布剛毛，端部常具長剛毛;無中附器;抱器端節細長，形態多變，常呈棒狀。

本研究記述1種，為黃明搖蚊（Phaenopsectraflavipes）（圖2J）。

5）薩博搖蚊屬（Sublettea Roback）。主要特征：體小型，翅長1.07 mm;體黃色，足淺黃色;觸角13節，觸角比0.36;生殖節肛尖無刺狀突起，中附器葉狀，上附器端部收縮，指附器長且彎曲。

本研究記述1種，為威爾薩博搖蚊（Subletteawilesi）（圖2K）。

6）長跗搖蚊屬（Tanytarsus van der Wulp）。主要特征：觸角13節，觸角比0.17 -2.20。部分種類腹部具色帶。翅膜區密被剛毛;R1翅室末端部分、R4+5脈和M1+2脈具剛毛，Cu脈無剛毛。生殖節第九背板帶中部分離，愈合成Y形或末端于肛尖基部愈合;肛尖有或無肛脊，肛脊之間常具小棘刺;上附器形狀多樣，下附器直或細而彎曲;中附器存在，呈葉狀。

世界廣布，中國記錄約40種，本研究記述1種，為臺灣長跗搖蚊（Tanytarsus formosanus）（圖2L）。

7）夏搖蚊屬（Xiaomyia Sc-ether&Wang）。主要特征：體小型，翅長1.17-1.44 mm;體黃，腹部具藍色帶。觸角13節，觸角比0.81-0.83。所有足均具單脛距，無脛櫛。生殖節抱器端節具齒，并可以轉動，抱器基節與下附器愈合。

中國記錄1種，本研究記述1種，為似足夏搖蚊（Xiaomyia aequipedes）（圖2M）。

2.2.2寡角搖蚊亞科（Diamesinae） 波搖蚊屬（Pot-thastia Kieffer）。主要特征：體中型，觸角13節，體棕黃，足淺黃色并具少量色斑，觸角比1.50-2.50。翅表面缺少剛毛，斑點色淺;前緣脈稍伸長，R2+3脈明顯，R4+5脈無剛毛。生殖節肛尖小，上有或無剛毛;抱器端節上存在較長的抱器端棘。

中國記錄3種，本研究記述1種，為雙角波搖蚊（Potthastia montium）（圖20）。

2.2.3 直突搖蚊亞科（Orthocladiinae）

1）環足搖蚊屬（Cricotopus van der Wulp）。主要特征：體型不等，小型至大型，翅長4.00 mni。足和背板通常有色斑間隔及明亮顏色的色環。觸角13節，觸角比0.30-2.10。翅膜區無剛毛，腋瓣具緣毛。足具色環，中足、后足極少具l根脛距，偽脛距缺失。生殖節肛尖常缺失;如果存在非常小，背板側毛退化;上附器扁平、圓狀或駝峰狀;下附器形態多樣，葉狀或被腹葉成對;抱器端節簡化，亞端背脊窄并在頂端具剛毛，抱器端棘存在或缺失。

世界廣布，中國記錄18種，本研究記述1種，為三束環足搖蚊（Cricotopus trifascia）（圖2P]。

2）中足搖蚊屬（Metriocnemus van der Wulp）。主要特征：體小到中型，翅長1.50-1.83 mm。體淡黃色或棕黑。觸角13節，觸角比0.80-1.50。翅膜區通常密具剛毛或具有細小至粗糙的刻點，臀角中部十分發達，R脈有毛，腋瓣具緣毛。生殖節肛尖細長，由基部到頂端逐漸變細尖，第九背板有或者沒有毛，抱器基節具有發達或明顯退化的下附器，有的為瓣狀下附器;抱器端節細長，具有小、尖三角形亞端背棘，或者亞端背棘不發達。

中國記錄6種，本研究記述1種，為一線中足搖蚊（Metriocnemus unilinearis）（圖2Q）。

2.2.4 長足搖蚊亞科（Tanypodinae）

1）無突搖蚊屬（Ablabesmyia Johannsen）。主要特征：體小到中型，翅長1.38-4.00 mm。體棕黃色，足具色帶。觸角13節，觸角比1.25-3.60。有些種類翅膜區有剛毛，翅上有明顯的翅斑。抱器基節基部輕微膨大，并向端部逐漸變窄，有明顯的背部剛毛和內側的剛毛簇;抱器端棘耳狀，末端變寬或有亞端部剛毛存在;上附器直或微彎曲，末端圓或尖;中附器多數比上附器短;下附器退化成一個小突起。

中國記錄16種，本研究記述1種，為前桅無突搖蚊（Ablabesmyia prorasha）（圖2R）。

2）前突搖蚊屬（Procladius Skuse）。主要特征：體小到中型，翅長1.30-4.20 mm。體棕或黑色，腹部有明顯的色斑帶。觸角13節，觸角比1.34-2.90。翅膜區有或無被毛，偶具翅斑;前緣脈超過R4+5脈很多，到達翅的頂端;MCu脈位于FCu脈前端;R2+3脈存在，并分叉，腋瓣具緣毛，臀角發達。生殖節肛尖寬，端部圓鈍;抱器基節基部寬，端部1/2處逐漸變窄;下附器多毛，明顯或不明顯或缺失;抱器端節粗壯或細長;抱器端棘短且粗。

中國記錄9種，本研究記述1種，為黑前突搖蚊（Procladius nigriventris）（圖2S）。

3 小結

本研究采集中國貴州省黔東南州雷山縣雷公山自然保護區的搖蚊昆蟲4亞科12屬18種，共計27個樣本。基于形態學對12屬的特征進行補充描述，并提供18種搖蚊成蟲的整體標本;在此基礎上使用DNA條形碼技術對27個樣本進行分子鑒定，NJ樹的結果顯示，數據集分離出18個mOTU，與傳統形態學鑒定一致，為進一步證明DNA條形碼能準確鑒別搖蚊科昆蟲提供數據支持。本研究的數據均已上傳中國DNA條形碼數據庫，在豐富中國搖蚊科數據庫的同時，也為雷公山自然保護區的生態環境研究和生物多樣性評估提供基礎數據。

參考文獻：

[1]周正賢，姚茂森，雷公山自然保護區科學考察集[M]貴陽：貴州人民出版社，1989

[2]李興春，王斌，梁芬，等.貴州雷公山自然保護區昆蟲資源多樣性調查初報[J].吉林農業，2011（4）：276-277.

[3]宋超.基于形態和分子數據的搖蚊亞科高級階元系統發育研究（雙翅目：搖蚊科）[D]天津：南開大學，2019.

[4] ARMITACE P D.CRANSTON P S，PINDER L C V.The Chironomi-dae： Biology and ecology of non-hiting midges[M].Springer sci-ence. Business media dordrecht. 1995.572.

[5] WANG X H.Nuisance chironomid midge recorded from China（ Dip-tera） [A]. HOFFRICHTER O.Late 20lh century research on Chi-ronomidae. An anthology from l3th internalional symposium on Chi-ronomidae[M].Shaker Verlag， Aachen， 2000.653-658.

[6] HEBERT P D N.CYWINSKA A.BALL S L.et al. Biological identi-fications chrough DNA barcodes IJ]. Proceedings of Lhe royal societyB： Biological sciences， 2003 ，270（ 1512）： 313-321.

[7] LIN X L，STUR E，EKREM T.Exploring genetic divergence in aspecies-rich insect genus using 2790 DNA barcodes IJl.PLos one，2015. 10（9）：1-24

[8] SONG C， WANG Q.ZHANGR L，et al.Exploring Lhe utility of DNAbarcoding in species delimitation of PobpediLum（ Tripodura） non-biting midges（ Diptera： Chironomidae）[J] .Zootaxa， 2016.4079（5）：534-550.

[9] SONG C， LIU W B.ZHANG R L，et al Two gynandromorphic spe-cies of Polypedilum Kieffer. 1912 （Diptera： Chironomirlae）， with DNA barcodes from OrienLal China IJl.Pan-Pacific encomologisc，2017.93（2）：95-104.

[10] SONG C.LIN X L.WANC Q，et al.DNA barcodes successfully de-limit morphospecies in a superdiverse insect genus [J].Zoologicascripta.2018.47（3）：1-14.

[11] QI X， WANC X H. ANDERSEN T， et al.A new species of ManoaFittkau（ Diptera： Chironomidae）， with DNA barcodes from XianjuNacional Park， Oriental ChinaEJl.200taxa.2017.4231（3）：398-408

[12] QI X. LIN X L，EKREM T， et al.A new surface gliding species ofChironomidae： An independent invasion of marine environmentsand its evolutionary implications[J].Zoologica scripta.2018 .48（1）：81-92

[13] LIN X L，YU H J，ZHANG R L，et al PoLypedilum r Cerobregma）heberti sp.IL（Diptera： Chironomidae） from Caoligong Mountains，Yunnan， China[J l.Zootaxa. 2019 .4571（2）：255-262.

[14]李小海，謝鎮國，余永富，等雷公山自然保護區生物物種新紀錄[J].農技服務，2014.31（6）：224-227.

[15]付梓源，謝鎮國，余德會，等雷公山保護區生物物種多樣性新紀錄[J].吉林農業，2015（ 12）：105-106.

[16] SAiTHER O A Clossarv of chironomid morphology terminology（ Diptera： Chironomidae）[J].Ent Scand Suppl， 1980. 14： 1-51.

[17]李麗梅中國南部翅扇類微型直突搖蚊（雙翅目：搖蚊科）分子鑒定[D].廣州：暨南大學，2014.

[18] FOLMER O.BLACK M.HOEHW，et al DNA primers for amplifi-cation of mitochondrial cvtochrome coxidase subunil l from di-verse metazoan invertebrates[J] .Molecular marine biology and bio-technology， 1994.3（5）：294-299.

[19] DUARTE S， BATISTA D， BARLOCHER F，et al.Some new DNAbarcodes of aquatic hyphomyceLe species [J]. Mycoscience， 2015，56（1）：102-108.

[20] WIEDERHOLM T. Chironomidae of the Holarctic region， Part 3：Adult males keys and diagnoses[M l.Sweden： Entomological soci-

ety oflund. 1989

作者簡介：余海軍（1994-），男，貴州雷山人，在讀碩士研究生，主要從事分子系統學研究，（電話）18322040463（電子信箱）yhjl8322040463@163.com;通信作者，王茜（1971-），（電話）13682014584（電子信箱）wqgt1999@163.com。