醬油中微量乙醇的氣相色譜分析方法的建立

劉曉艷，覃旋，錢敏，白衛東*，黃漢聰，楊紅，黃丹彤

(1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣州 510225；2.廣州市廣式傳統食品加工與安全控制 重點實驗室，廣州 510225；3.廣州市如豐果子調味食品有限公司，廣州 510300)

作為我國傳統的調味食品，醬油一般是以大豆或脫脂大豆、小麥或麩皮等為原料，經多種微生物共同發酵而成。醬油的香氣是評價其質量的重要指標之一，而乙醇是醬油重要的特征香氣成分[1-4]，乙醇的含量對醬油的營養價值與衛生指標也有重要影響[5-7]。日本對出口的A級醬油規定，其乙醇的含量要大于800 mg/dL[8]。目前我國醬油生產中采用的純種發酵技術使得所生產的醬油香氣較單薄，所以醬油的生產將傾向于在發酵中后期添加特定酵母菌來加強酒精發酵，以產生適量的乙醇改善醬油的風味[9-11]。因此，檢測醬油中乙醇含量是醬油生產過程中控制質量、指導生產不可缺少的手段。目前，采用氣相色譜對酒類、藥品、香精香料化妝品中微量乙醇進行分析檢測的報道較多[12-18]，而醬油中乙醇的氣相色譜分析尚未見文獻報道。

本文采用氣相色譜對醬油中微量乙醇進行分析測試，省去了傳統測試方法中蒸餾過程與手工測定比重等繁瑣操作，大大簡化了乙醇測試的操作過程；且減少了萃取、蒸餾等處理過程中乙醇的損失。分析的速度快、干擾小、靈敏度高、數據可靠，適用于醬油生產及醬油產品中微量乙醇的檢測，研究結果為醬油釀造過程中質量控制及保證醬油品質提供了技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗原料：醬油，購于超市。

乙醇、乙腈(色譜純)：Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設備

7820A氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司；旋轉蒸發儀 東京理化器械獨資工廠；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；離心機、渦旋混合器 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 萃取方法的選擇

取5，2，2 mL醬油至 15 mL 離心管中，分別加入5，8，10 mL乙腈，擰緊瓶蓋，漩渦混勻1 min，以4000 r/min離心3 min，將上層有機相轉入進樣瓶中，供 GC測試。

對比醬油樣品與乙腈的在V(醬油)∶V(乙腈)為1∶1(5 mL醬油+5 mL乙腈)、V(醬油)∶V(乙腈)為1∶4 (2 mL醬油+8 mL乙腈)、V(醬油)∶V(乙腈)為1∶5(2 mL醬油+10 mL乙腈)時樣品中乙醇提取的量，得到萃取的最佳條件。

1.3.2 色譜分析條件

色譜柱：HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID檢測器溫度：250 ℃；氫氣流速：35 mL/min；空氣流速：400 mL/min；尾吹(N2)流速：25 mL/min；柱流速：1 mL/min；分流比30∶1；進樣口溫度：200 ℃；柱溫平衡時間：1.0 min；程序升溫：40 ℃保持5.5 min，以20 ℃/min的速度升至200 ℃，保持后，運行30 min。

1.3.3 標準曲線的繪制

準確稱取乙醇1.0000 g，用超純水定容到100 mg/L容量瓶中，得到10 mg/mL的儲備液；分別準確量取10.0 mg/mL儲備液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于100 mL容量瓶中，用超純水定容，得到濃度為10，20，40，60，80，100 mg/L的標準溶液。按 1.3.2色譜分析條件上機測定。以標準溶液的濃度為橫坐標，對應的峰面積值為縱坐標，繪制乙醇標準曲線；并進行線性回歸，計算相關系數R2。

1.3.4 方法精密度

取3種醬油樣品，每種2 mL 至 15 mL 離心管中，采用 1.3.1 優化后的樣品提取方法萃取后，按 1.3.2色譜分析條件上機分析，每種樣品由同一操作人員連續重復分析檢測 6 次。根據乙醇標準曲線，求出乙醇含量，并計算方法的相對標準偏差(RSD)。

1.3.5 加標回收率

分別取2 mL 醬油于3個15 mL離心管中，加入乙醇對照品(乙醇濃度分別200，300，500 mg/L)，制備成3組不同濃度的樣品。采用 1.3.1 優化后的樣品提取方法萃取后，按 1.3.2 色譜條件進樣，上機測定，所得的乙醇含量減去醬油樣品中的乙醇含量，即為加入乙醇的實測值。將實測值與理論值比較，得到方法的回收率。

1.3.6 方法的初步應用

采用本文建立的方法檢測5種市售醬油中的乙醇含量，重復檢測5次。

2 結果與分析

2.1 萃取條件的選擇

使用乙腈為醬油中乙醇的萃取劑時，乙腈的用量對萃取結果有重要影響。分析比較不同乙腈用量對醬油中乙醇萃取結果的影響，結果見圖1。

圖1 不同乙腈用量對乙醇萃取結果的影響Fig.1 The effect of acetonitrile volume on ethanol extraction

由圖1可知，當V(醬油)∶V(乙腈)為1∶4(8 mL乙腈+2 mL醬油)時，所檢測的乙醇含量最高，說明當V(醬油)∶V(乙腈)為1∶4(8 mL乙腈+2 mL醬油)時萃取效果最好。

2.2 線性范圍和檢出限

取1.3.3配制的100 μg/L乙醇標品工作液，在1.3.2色譜分析條件下進行分析測定，得100 μg/L乙醇標品的氣相色譜圖，見圖2。

圖2 100 μg/L乙醇標品的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of 100 μg/L ethanol standard solution

由圖2可知，在該色譜條件下，乙醇的保留時間為4.327 min，色譜峰分離良好。

將配制好的6個標準工作溶液在1.3.2色譜條件下測定，得到乙醇含量。以標準工作溶液的進樣濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制乙醇的標準曲線，并進行線性回歸(見圖3)，計算相關系數。

圖3 乙醇標準曲線Fig.3 The standard curve of ethanol

由圖3可知，乙醇標準曲線的回歸方程為y=0.2844x+0.1374，相關系數R2=0.998，說明當乙醇濃度在10～100 mg/L范圍時，方法的線性關系良好；以3倍信噪比(S/N=3)確定檢測限2.3 mg/L，滿足微量乙醇的定量分析要求。

2.3 精密度試驗

采用本方法對3個醬油樣品中乙醇分別進行了 6 次平行獨立測定，以考察檢測方法的精密度，結果見表1。

表1 精密度試驗結果(n=5)Table 1 The precision test results(n=5)

由表1可知，3組測定結果的RSD分別為2.61%、2.80%、2.55%，說明采用本方法的精密度良好。

2.4 加標回收率

對醬油樣品中乙醇進行了加標回收試驗，3種不同濃度加標水平為200，300，500 mg/L。按以上試驗方法進行測定，計算醬油中乙醇的平均加標回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表2。

表2 加標回收率試驗結果Table 2 The recovery test results

由表2可知，本方法的加標回收率為97.86%～101.87%，RSD為0.58%～2.91%，說明本方法的準確度能夠滿足醬油中微量乙醇的分析要求。

2.5 醬油樣品的測定

按照本文建立的方法測定了市場上5種醬油中乙醇的含量，結果見表3。

表3 實樣測試結果Table 3 The sample testing results

由表3可知，5種醬油中乙醇的含量為479.60～4809.33 mg/L，與相關報道一致[19-20]；上述5種醬油中乙醇的含量與日本出口的A級醬油中乙醇的含量尚有一定差距，可能與我國醬油生產廠家忽視了對乙醇含量的檢測和醬油發酵工藝的研究有關。RSD在0.85%～3.78%，說明本文建立的采用氣相色譜測定醬油中微量乙醇的方法有良好的適用性，能夠滿足醬油中微量乙醇的檢測要求。

3 結論

本文建立了氣相色譜測定醬油中微量乙醇的方法：采用乙腈為溶劑，醬油∶乙腈為1∶4(V/V)。該方法線性關系良好，相關系數為0.998，檢出限為2.3 mg/L，樣品的加標回收率為97.86%～101.87%，相對標準偏差RSD為0.58%～2.91%。實際樣品分析結果表明，該方法具有前處理簡便、分析時間短等特點，而且其精密度高，能滿足醬油生產及醬油產品中微量乙醇的檢測，研究結果為醬油釀造過程中質量控制及保證醬油品質提供了技術支持。