GC-MS分析四川主產(chǎn)地竹葉花椒的揮發(fā)性成分

徐雙美，楊森，李澤娜，楊丹，陳鴻平，劉友平

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，成都 611137)

1 概述

竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)為蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum)植物。近年來，以竹葉花椒及其栽培品種為主的青花椒產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，在四川省已經(jīng)形成的川西、川中、攀西3個(gè)花椒特色優(yōu)勢(shì)種植區(qū)中，除了以漢源為代表的川西為紅花椒集中區(qū)外，以鹽邊縣、鹽源縣、金陽(yáng)等為代表的攀西地區(qū)和以平昌縣、通江縣、渠縣等為代表的川中地區(qū)都為竹葉花椒集中區(qū)，且多為地方收載品種[1]。在使用方面，竹葉花椒品種可作為藥用植物、觀賞植物、烹飪用途的重要來源，因此這種植物不僅用于制藥，如驅(qū)蟲、腹痛、牙痛、消化不良等[2-5]，也用于調(diào)味品和香料工業(yè)[6-7]。

不同產(chǎn)地竹葉花椒中揮發(fā)性物質(zhì)的組成和含量易受氣候條件(日照時(shí)間、降水量、干燥度、氣溫等)以及土壤特性等的影響而存在差異，因此，近年來對(duì)各品種花椒的揮發(fā)性物質(zhì)也進(jìn)行了一系列的研究。如Liu等[8]分析鑒定出竹葉花椒32種香味活性化合物，其中芳樟醇的氣味活性值(OAV)最高，對(duì)香氣貢獻(xiàn)最大。Nirmala Phuyal等[9]發(fā)現(xiàn)尼泊爾竹葉花椒葉揮發(fā)性組分中含量較高的3種主要有芳樟醇、檸檬烯和十一烯-2-酮。王思思等[10]將4大產(chǎn)區(qū)紅花椒樣品分為三類，即西南地區(qū)一類，西北地區(qū)一類，華東、華北一類。袁華偉等[11]也從香辛料花椒中鑒定出主要揮發(fā)性成分芳樟醇。蒲鳳琳等[12]發(fā)現(xiàn)藥典記載的青、紅花椒主要揮發(fā)性物質(zhì)為芳樟醇，但青花椒中的含量高于紅花椒。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

GC-MS-QP 2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、AOC-5000 Plus頂空進(jìn)樣器、Agilent 19091S-433柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國(guó)Agilent公司；AUW220D分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；CNW 20 mm鉗口20 mL平底透明頂空樣品瓶。α-Al2O3粉末為分散劑(批號(hào)：Lot.No. JF4A，日本島津公司)。

2.2 樣品收集

竹葉花椒樣品見表1。

表1 竹葉花椒樣品Table 1 The samples of Zanthoxylum armatum DC.

續(xù) 表

2.3 樣品制備

精密稱取竹葉花椒粉末(過60目篩)1.00 g，置于20 mL頂空瓶中，密封，置于靜態(tài)頂空進(jìn)樣器中，在180 ℃下加熱60 min。

2.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件[13]

2.4.1 頂空條件

頂空保溫平衡溫度：180 ℃；頂空保溫平衡時(shí)間：30 min；水平往復(fù)振蕩器振蕩速率：250 r/min；進(jìn)樣針溫度：100 ℃；進(jìn)樣量：1.0 mL；進(jìn)樣針沖洗時(shí)間：2 min。

2.4.2 色譜條件

色譜柱：Agilent 19091S-433柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：109 ℃；載氣：高純氦氣；升溫程序：50 ℃開始以2 ℃/min升至120 ℃，保持35 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保持27 min；線速度：36.5 cm/s；分流比：20∶1；進(jìn)樣體積：1 mL。

2.4.3 質(zhì)譜條件

離子源：EI；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；電離電壓：1.0 kV；接口溫度：250 ℃；質(zhì)量掃描范圍：45～500 m/z，掃描時(shí)間：2.50～60.00 min；溶劑延時(shí)：2 min。

2.4.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2013及SPSS 20.0進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)以及主成分分析等處理。圖形采用Origin 2015繪制。

2.5 結(jié)果與分析

2.5.1 頂空GC-MS揮發(fā)性成分檢測(cè)結(jié)果

22個(gè)產(chǎn)地竹葉花椒樣品揮發(fā)性成分的總離子流圖見圖1，結(jié)果見表2(按平均含量高低列出)。

圖1 不同產(chǎn)地?fù)]發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 The total ion flow diagram of volatile components from different places of origin

表2 不同產(chǎn)地?fù)]發(fā)性成分相對(duì)含量Table 2 The relative content of volatile components from different places of origin

續(xù) 表

續(xù) 表

2.5.2 初步統(tǒng)計(jì)分析

由表2可知，22個(gè)產(chǎn)地累計(jì)鑒別出75個(gè)成分，其中S21通江縣樣品鑒定出的揮發(fā)油成分?jǐn)?shù)最多，有37個(gè)，其次是S14鹽源縣和S16三臺(tái)縣樣品有30個(gè)，S15渠縣、S17夾江縣樣品有27個(gè)，S11大英縣、S12米易縣、S13平昌縣有26個(gè)，22個(gè)產(chǎn)地共有揮發(fā)性成分有11個(gè)，這些共有成分的總相對(duì)含量超過82%，表明這22個(gè)產(chǎn)地的揮發(fā)性成分相似。

選取共有成分化合物做百分比堆積柱形圖(見圖2)，這11種化合物在各地樣品揮發(fā)性成分總量中占比達(dá)82.89%～94.69%，并且主要為烯類、醇類。

圖2 四川22個(gè)產(chǎn)地竹葉花椒共有成分百分比堆積圖Fig.2 The total composition percentage of 22 Zanthoxylum armatum DC. samples from different producing areas in Sichuan Province

由圖2可知，芳樟醇、檸檬烯和側(cè)柏烯在各個(gè)產(chǎn)地占的比值都比其他組分大，因此竹葉花椒的主要揮發(fā)性成分有芳樟醇、檸檬烯和側(cè)柏烯，而S18寧南縣樣品的芳樟醇相對(duì)含量最高，為56.54%；S14鹽源縣樣品的檸檬烯相對(duì)含量最高，為44.46%；S22德昌縣樣品的側(cè)柏烯相對(duì)含量最高，為21.89%。可知22個(gè)不同產(chǎn)地樣品揮發(fā)性主要成分含量差異較為明顯。

2.5.3 多元統(tǒng)計(jì)分析2.5.3.1 主成分分析

按照KMO(Kaiser-Meyer-Olkin)和Bartlett球形度檢驗(yàn)結(jié)果，選取22個(gè)樣品全部共有成分組成11×22階矩陣進(jìn)行主成分分析。此時(shí)的KMO檢驗(yàn)結(jié)果為0.648，非常接近0.7(Kaiser給出的一般KMO度量標(biāo)準(zhǔn))，可以進(jìn)行因子分析。將選取的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0中進(jìn)行主成分分析，得載荷圖(見圖3)，2個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為93.417%和4.548%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為97.965%。

圖3 22個(gè)產(chǎn)地竹葉花椒主成分分析載荷圖Fig.3 The load diagram of principal component analysis of Zanthoxylum armatum from 22 places of origin

由圖3可知，采用主成分分析法可以將22個(gè)種植區(qū)樣品分成兩類。第一類C1有S1、S2、S3、S5、S9、S12、S13、S21，第二類C2有S4、S6、S7、S8、S10、S11、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S22。即C1有峨眉山、平昌縣、瀘縣、南充營(yíng)山縣、南充儀隴縣、米易、平昌縣、通江縣，C2有洪雅縣、冕寧縣、德昌縣、布拖縣、大英縣、鹽源縣、達(dá)州渠縣、綿陽(yáng)三臺(tái)縣、樂山夾江縣、寧南縣、西昌縣、金陽(yáng)縣、由此看出，C1類產(chǎn)地多集中于川中地區(qū)，C2類產(chǎn)地多集中于攀西地區(qū)，并且涼山彝族自治州也都集中于C2類。

2.5.3.2 相似度評(píng)價(jià)

為得到聚類分析中兩個(gè)類別內(nèi)各樣品的相似度,使用SPSS 20.0做Pearson相關(guān)性分析，得相關(guān)系數(shù)矩陣表(見表3)。

表3 竹葉花椒揮發(fā)性成分相關(guān)系數(shù)矩陣Table 3 The correlation coefficient matrix of volatile components in Zanthoxylum armatum

由表3可知，第一類樣品的相似度在0.883～0.995之間，第二類樣品的相似度在0.701～0.999之間。根據(jù)各成分的標(biāo)準(zhǔn)偏差，芳樟醇、側(cè)柏烯和檸檬烯的標(biāo)準(zhǔn)偏差最大且含量最高，所以芳樟醇、側(cè)柏烯和檸檬烯在這兩類樣品中的含量差異是造成上述分類結(jié)果的主要原因。同時(shí)第二類中雖然S14鹽源縣和S22德昌縣屬于同一個(gè)州，但其芳樟醇、側(cè)柏烯和檸檬烯的相對(duì)含量差異較大，導(dǎo)致它們的相似度只有0.701。

2.5.3.3 兩個(gè)類別差異分析

得出22個(gè)樣品表現(xiàn)出具有明顯差異的兩個(gè)類別C1和C2，分別對(duì)這兩個(gè)類別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)C1類樣品的成分一共有37個(gè)，而C2類的有27個(gè)，C1和C2類相對(duì)含量前三的均是芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏烯，其次是β-月桂烯、γ-松油烯。C1類中芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏烯的平均總相對(duì)含量均高于C2類，由于C1類產(chǎn)地多集中于川中地區(qū)，C2類產(chǎn)地多集中于攀西地區(qū)，川中地區(qū)的揮發(fā)性組分和含量可能高于攀西地區(qū)。在非共有成分上，C1類有共同成分乙酸芳樟酯，C2類有共同成分α-松油醇，同時(shí)C2類中的涼山彝族自治州還有共同成分順式羅勒烯、萜品醇、乙酸芳樟酯、大根香葉烯D。

2.5.4 結(jié)論與討論

利用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)出四川22個(gè)產(chǎn)地?fù)]發(fā)性成分75個(gè)，其中共有成分11種，分別包含有醇類物質(zhì)1種、烯類物質(zhì)9種、烯烴物質(zhì)1種，含量較高的共有成分有：芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏烯，其次是β-月桂烯、γ-松油烯。總相對(duì)含量超過82%，表明這22個(gè)產(chǎn)地的揮發(fā)性成分相似，但是主要成分含量相差較大，使得其在統(tǒng)計(jì)結(jié)果上呈現(xiàn)出有差異的兩個(gè)類別，C1類產(chǎn)地多集中于川中地區(qū)，C2類產(chǎn)地多集中于攀西地區(qū)。C1類樣品的成分一共有37個(gè)，而C2類的有27個(gè)，C1和C2類相對(duì)含量前三的均是芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏烯，其次是β-月桂烯、γ-松油烯。C1類中芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏烯的平均總相對(duì)含量均高于C2類，在非共有成分上，C1類有共同成分乙酸芳樟酯，C2類有共同成分α-松油醇，因此，這兩個(gè)成分可能是區(qū)分不同產(chǎn)地竹葉花椒的關(guān)鍵化合物。

竹葉花椒揮發(fā)性組分的不同賦予其特有的香氣特征。11種特征物中，芳樟醇具有催眠、抗抑郁、抗氧化以及抗衰老等作用，并伴有清甜的花香和木香，檸檬烯有檸檬果香，側(cè)柏烯有殺蟲劑味，β-月桂烯有清涼、中藥味，萜品烯有甜味，松油醇有清香、樹脂香，α-蒎烯有松木香、樹脂香，α-水芹烯有柑橘香、清香、黑胡椒香，γ-松油烯有柑橘香、萜香，石竹烯有辛香、木香、柑橘香、樟腦香，α-松油醇有類似紫丁香的清香，這22個(gè)產(chǎn)地的共有成分均是香氣活性成分。C1類芳樟醇、檸檬烯、側(cè)柏烯、β-月桂烯相對(duì)含量較高，說明其香氣偏花香和木香。有研究表明，竹葉花椒藥材揮發(fā)油樣品主要含有芳樟醇、檸檬烯、乙酸芳樟酯等[14]，與本文研究的主要揮發(fā)性組分基本一致。在比較不同產(chǎn)地?fù)]發(fā)性成分的區(qū)別上，魏泉增等[15]發(fā)現(xiàn)乙酸芳樟酯和乙酸松油酯可能是區(qū)分不同產(chǎn)地花椒的關(guān)鍵化合物。