高通量測序技術分析腌漬白菜液中原核微生物群落結構

賈晶晶，易洋，韓睿媛，燕平梅

(太原師范學院 生物系，山西 晉中 030012)

我國通過制作腌漬白菜來存儲蔬菜的歷史久遠，甚至可以追溯到商朝[1]。蔬菜腌漬的原理是利用食鹽的高濃度和高滲透壓來進行腌制，研究表明，成品腌漬菜在與空氣隔絕的情況下，在溫度20 ℃以下，食鹽含量在12%～15%時，能夠保藏180 d以上，并能長期保藏[2]。高鹽食品之所以能夠較長時間地保存而不致于質地軟化，最主要的原因是高食鹽的高滲透壓對有害微生物的抑制作用，從而可以有效阻止有害微生物分泌的酶對食品細胞結構的破壞[3]。腌漬白菜是以白菜為原料，利用有益微生物的活動賦予白菜特殊的風味和營養價值對白菜進行保藏的一種方式。腌漬蔬菜不僅可以提高蔬菜的利用率，還能使蔬菜的食用保質期得以延長，此外，腌漬蔬菜極具風味、易于保存。它制作方法簡便，風味獨特，適量食用還可調節腸胃，增強食欲，能為人體提供充足的營養物質[4]。

我國腌漬蔬菜產業從原料選取、發酵腌漬工藝、產品保藏到加工管理均存在諸多不足[5]。尤其是其中存在的食品安全問題[6-7]，嚴重制約其大規模的工業化發展。而要促進腌漬白菜由自然發酵到大規模生產的轉變，對于自然發酵腌漬白菜的微生物群落結構的研究是十分必要的[8-9]。從20世紀80年代起至今，腌漬白菜中微生物群落結構的研究一直備受關注[10]。隨著分子生物學的蓬勃發展，高通量測序等技術逐漸被應用于腌漬蔬菜中微生物的研究[11-12], 食鹽在為腌漬白菜增味的同時，還起到脫水和防止雜菌污染的作用，與腌漬白菜中亞硝酸鹽含量和微生物群落結構息息相關[13]。本次實驗采用高通量測序技術研究12%食鹽濃度對腌漬白菜液微生物群落結構的影響，發現高食鹽濃度腌漬白菜液中的優勢微生物，對保障食品安全、提高人民健康水平是十分必要的，為推動我國腌漬白菜產業的大規模工業化發展提供了數據參考，以促進腌漬蔬菜的科學可持續發展[14-15]，更好地為食品安全和人民健康服務。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗材料與試劑

白菜、無碘食鹽：購于山西省太原市解放路永輝超市；DNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 實驗儀器

DYY-6C瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；離心機：美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腌漬白菜的制作

本實驗采用傳統自然發酵方法腌制：將購買的新鮮白菜修整、洗凈、瀝干并切分成片狀備用。將選好的腌漬白菜壇用開水燙洗2次備用。將預處理過的白菜取200 g裝入腌漬白菜壇中，并加入12%濃度的食鹽水直至淹沒全部白菜，蓋好壇蓋。然后將壇蓋密封，保證發酵在適宜條件下進行。同時設置3個平行實驗，發酵14 d。

1.2.2 樣品采集及樣品DNA的提取

待腌漬白菜發酵至14 d時，用5 mL的無菌移液器分別從腌漬白菜壇的上、中、下三部分的隨機位置各吸取12 mL發酵液，共計36 mL發酵液于離心管中，設置10000 r/min離心10 min，倒掉上清液，用1.5 mL的EP管存放離心得到的菌體。將3個平行實驗得到的菌體均勻混合，備用。最后根據DNA提取試劑盒的要求對收集到的混合菌體進行DNA的提取。提取成功后用0.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并測定其DNA的濃度。

1.2.3 高通量測序

將提取得到的DNA樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.2.4 數據分析

根據97%相似性，將非重復序列進行操作分類單元(OTU)聚類。然后采用RDP Classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，統計12%食鹽濃度腌漬白菜的微生物在不同水平的群落組成。利用Mothur軟件繪制稀釋性曲線，利用QIIME軟件計算樣品的各種多樣性指數，利用Excel軟件構建群落分布柱狀圖、數據分析表等。

2 結果與分析

2.1 腌漬白菜中微生物群落結構組成

分別在不同水平對樣品的群落組成進行統計分析，所得結果表明：樣品中共有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍藻菌門(Cyanobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)6個菌門。整理分析12%食鹽濃度發酵的腌漬白菜中微生物群落在門水平的相對含量數據表(見表1)和柱狀圖(見圖1)。

表1 12%食鹽濃度的腌漬白菜微生物群落 在門水平上的相對含量

圖1 12%食鹽濃度的腌漬白菜微生物群落 在細菌門水平上的相對含量Fig.1 The relative content of microbial community of pickled Chinese cabbage at the phylum level with 12% salt concentration

由表1和圖1可知，變形菌門(67.01%)含量最高，厚壁菌門含量(32.39%)次之，芽單胞菌門含量最低。由此認為，12%食鹽濃度腌漬白菜中變形菌門為最優勢菌門。

表2 12%食鹽濃度腌漬白菜微生物群落 在綱、目水平上的相對含量Table 2 The relative content of microbial community of pickled Chinese cabbage at the class and order levels with 12% salt concentration

通過對樣品在綱和目水平的微生物群落分布的統計分析(見表2)可知，在變形菌門中，主要優勢菌綱為Gammaproteobacteria，其含量高達99.17%，其中Enterobacteriales(72.05%)含量最高，Alphaproteobacteria含量較少，未統計到Deltaproteobacteria。而厚壁菌門中Bacilli(99.99%)為主要優勢菌綱，該綱中Lactobacillales(86.05%)含量最高，Clostridia含量較少。變形菌門與厚壁 菌門的相對含量高達99.40%，再次是擬桿菌門(0.57%)，其中均為Bacteroidia，Sphingobacteriales的含量最高，未檢測到Bacteroidales細菌。而放線菌門、藍藻菌門和芽單胞菌門的含量都很少，約占總含量的0.02%。

12%食鹽濃度發酵的腌漬白菜中細菌在屬水平上的分布見圖2。

圖2 12% 食鹽濃度腌漬白菜水中的細菌 在屬水平上的相對含量Fig.2 The relative content of bacteria in the pickled Chinese cabbage liquid at the genus level with 12% NaCl concentration

由圖2可知，乳球菌屬(Lactococcus)含量最高，為最優勢菌屬，約占總體的26.45%。第二優勢菌屬為普羅威登斯菌屬(Providencia)，含量約占樣本總體的24.89%。再其次為腸桿菌屬(Enterobacter)，約占總體的21.28%。另外，腸桿菌科中還有未分類的菌屬，占樣本總數的12.06%。此外，還有Lelliottia(1.23%)，Acinetobacter(1.29%)，Delftia(1.29%)，Comamonas(1.22%)，Weissella(0.26%)，Bacillus(3.62%)等菌屬。樣本微生物群落中Aerococcus，Christensenellaceae_R-7_group，Bacteroides，Rikenellaceae_RC9_gut_group，Cloacibacterium，Bifidobacterium，Cutibacterium，norank等菌屬含量均為0。

2.2 腌漬白菜中微生物多樣性分析

從所得有效序列中隨機選取一定數量進行稀釋曲線的繪制(見圖3)，可以看到曲線趨于平緩，即認為測序結果能夠基本反映出腌漬白菜中細菌的豐富度及多樣性。

圖3 不同食鹽濃度樣品的稀釋曲線Fig.3 The dilution curves of samples with different salt concentration

通過分析樣品測序所得序列，計算樣品的各項多樣性指數，見表3。

表3 12% 食鹽濃度腌漬白菜中Alpha多樣性指數Table 3 The Alpha diversity indexes of pickled Chinese cabbage with 12% NaCl concentration

由表3可知，12%食鹽濃度腌漬白菜的香農指數較低。而12%食鹽濃度腌漬白菜的辛普森指數較高。綜合分析認為，12%食鹽濃度腌漬白菜的微生物多樣性較低。原因可能是食鹽濃度的不同造成腌漬白菜水的滲透壓不同，影響了發酵過程中微生物群落結構的組成。

3 結論

本文通過高通量測序研究12%食鹽濃度腌漬白菜液中原核微生物群落結構。結果表明，12%食鹽濃度發酵的腌漬白菜中包含6個菌門，其中變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為優勢菌門，丙型變形菌綱(Gammaproteobacteria)和桿菌(Bacilli)為其主要優勢菌綱，普羅威登斯菌屬(Providencia)和乳球菌屬(Lactococcus)為最優勢菌屬。