老壇水發酵與接種發酵過程中細菌菌落與揮發性成分差異研究

李雨萌，曾里，吳正云

(四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065)

1 概述

四川泡菜是我國傳統特色發酵食品的典型代表之一。我國泡菜以自然發酵為主，即利用依附在蔬菜本表面的微生物，加入食鹽水進行發酵制成的產品，泡菜發酵口感爽脆、風味獨特。已有研究表明[1-3]，老壇水發酵和接種發酵泡菜的品質皆優于自然發酵，但目前國內泡菜行業仍多采用自然發酵(二輪鹽漬工藝)[4]。云琳等對不同發酵方式蘿卜泡菜的品質差異進行了 研究，研究表明老壇水發酵和接種發酵泡菜中的風味物質皆比自然發酵中豐富，接種發酵與老壇水泡菜間揮發性物質存在差異的原因和機理仍待探究。故本研究采用老壇水和接種菌劑兩種方法發酵豇豆，監測發酵過程中細菌群落和揮發性物質的變化，分析發酵液中細菌群落組成與揮發性物質的差異性，進一步從微生物角度探究兩種發酵方式揮發性物質差異性的原因，旨在為接種泡菜工業化發展提供一定的理論支持和參考。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 實驗樣品與試劑

老壇水：取自發酵時間1年左右的老壇水；豇豆：購于郭家橋農貿市場。用郭家橋農貿市場購買的土陶罐泡制。每種方法設置3個平行樣本。

2.1.2 實驗儀器

SHZ-D(Ⅲ)型循環水真空泵 上海邦西儀器科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 北京科偉永興儀器有限公司；氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；固相微萃取頭、固相微萃取進樣手柄 西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；E.Z.N.A.水樣DNA提取試劑盒 美國Omega公司；ABI GeneAmp 9700型PCR儀 美國ABI公司；MISEQ測序儀 美國Illumina公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 發酵工藝

老壇水發酵：豇豆用無菌水清洗3遍，加入40 g/L老壇泡菜水，裝壇密封發酵。

接種發酵泡菜的制備：植物乳桿菌和腸膜明串珠菌等比例接種[5]，接種比例為0.5%，其他工藝同老壇水發酵。

檢測樣的制備：豇豆和泡菜液按質量1∶1混合均漿。

2.2.2 泡菜樣品揮發性成分的固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用(SPME-GC-MS)分析

固相微萃取(SPME)條件：取5 g泡菜樣品加入頂空瓶中，在50 ℃水浴條件下平衡15 min。然后插入萃取針，在泡菜樣品上空萃取20 min,然后拔出萃取針并插入GC-MS進樣口中，熱解吸5 min進行分析。

氣相色譜(GC)條件：色譜柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。GC程序(總程序時間55 min)：初溫40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升溫至100 ℃；然后以3 ℃/min升溫至175 ℃；最后以10 ℃/min升溫至215 ℃，保持10 min，不分流，進樣口溫度250 ℃。

質譜(MS)條件：電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，質譜掃描范圍(m/z)：35.00～400.00。

2.2.3 微生物群落檢測

利用E.Z.N.A.?水樣DNA提取試劑盒進行細菌群落總DNA抽提。對16S rRNA進行擴增，擴增程序：95 ℃預變性3 min，27個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s)，然后以72 ℃穩定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存。PCR反應體系：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol/L)0.8 μL，下游引物(5 μmol/L) 0.8 μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng。擴增后進行PCR產物的回收、定量。根據 Illumina MiSeq平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 300的文庫。

3 結果與討論

3.1 老壇水、接種泡豇豆發酵過程中的細菌群落結構

研究發現[6-7]，泡菜發酵階段與風味物質相關的重要微生物主要是細菌群落，故本文主要對細菌群落進行研究。

兩種豇豆泡菜在0～15 d發酵周期的細菌群落的變化情況見圖1和圖2。

圖1 老壇水和接種發酵豇豆泡菜細菌門水平群落結構組成Fig.1 The community structure composition in the phylum level of bacteria in laotan water fermented and inoculation fermented cowpea pickles

圖2 老壇水和接種發酵豇豆泡菜細菌屬水平群落結構組成Fig.2 The community structure composition in the genus level of bacteria in laotan water fermented and inoculation fermented cowpea pickles

在門水平上，老壇水泡豇豆中的主要細菌門類是厚壁菌門(Firmicutes)、Epsilonbacteraeota和變形菌門(Proteobacteria),另有少量放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、哈拉厭氧菌門(Halanaerobiaeota)和藍細菌門(Cyanobacteria)。接種泡豇豆中的主要細菌門類是厚壁菌門(Firmicutes)，其他門類相對豐度甚微。屬水平上，接種發酵豇豆中細菌群落豐度遠不如老壇水發酵豇豆。老壇水泡豇豆中優勢菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)、弓形桿菌屬(Arcobacter)、片球菌屬(Pediococcus)及嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。接種泡豇豆中優勢菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)和鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)，少量嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。接種泡豇豆發酵過程中，由于接種的乳酸菌和腸膜明串珠菌皆屬于乳桿菌屬，故發酵初始乳酸菌屬相對豐度高，加上發酵過程產酸，抑制了其他菌的生長，保持了乳酸菌的優勢地位，發酵后期相對豐度接近98%。老壇水泡菜發酵過程中乳酸菌屬相對豐度先上升后下降，原因是隨著發酵的進行乳酸菌產酸雜菌,生長受到抑制，乳酸菌屬的相對豐度上升。而乳酸菌非絕對優勢菌群，因此當發酵后期酸度降到一定值時，乳酸菌自身生長受到抑制，其他菌種開始慢慢增長。

3.2 老壇水、接種發酵豇豆泡菜發酵過程中揮發性成分分析

續 表

圖3 老壇水豇豆泡菜發酵過程中揮發性成分相對含量的變化Fig.3 The change in relative content of volatile components in the fermentation process of laotan water fermented cowpea pickles

圖4 接種豇豆泡菜發酵過程中揮發性成分相對含量的變化Fig.4 The change in relative content of volatile components in the fermentation process of inoculation fermented cowpea pickles

泡菜的發酵過程主要為乳酸菌的乳酸發酵，發酵前期主要進行異型乳酸發酵，產生醇類、醛類、有機酸；發酵后期主要進行同型乳酸發酵，產生乳酸。發酵過程除產生大量乳酸外，還會形成乙酸、丙酸等有機酸和異戊醇、丁醇等醇類物質。隨著發酵進行這些有機酸又會與醇類反應生成乙酸乙酯、乳酸異戊酯等酯類揮發性成分[8]。由表1可知，在老壇水泡豇豆中檢測出的揮發性風味成分約有41種，其中有15種為老壇水泡豇豆獨有。老壇水泡豇豆含量較高的揮發性物質是酯類、醇類和酸類，以酯類為主。在接種泡豇豆中檢測出的揮發性風味成分約有36種，其中11種為接種泡豇豆獨有。接種泡豇豆含量較高的揮發性物質是醇類、酯類、酸類及含硫化合物。老壇水泡豇豆的醇類和酯類的種類和相對含量皆高于接種泡豇豆。由圖3和圖4可知，兩種發酵方式的主要風味成分酯類、酸類物質都呈先上升后下降的趨勢，醇類物質的相對含量變化不大。接種泡豇豆發酵過程中含硫化合物從發酵第9天開始檢出，且相對含量迅速增加。

與現有蘿卜等研究結果不同[9-10]，由于豇豆本身酯類化合物含量高[11]，故酯類物質雖然本身閾值較大，仍對泡豇豆風味有積極影響。老壇水泡豇豆酯類相對含量明顯高于接種發酵，說明老壇發酵更能保留豇豆本身風味。醇類物質在整個發酵周期相對含量較穩定。醇類物質一部分是原料本身具有的，另一部分則是微生物發酵產生的；此外，醇類物質還能與有機酸反應生成酯類物質，為泡菜的香氣做出一定的貢獻。在醇類物質中，大部分對豇豆泡菜的風味有積極影響，如α-松油醇具有紫丁香氣味，芳樟醇具有花香味，1-辛烯-3-醇有菜豆香[12]。異戊醇還具有烘托酯香的作用，能夠使香味更豐腴。但也存在給泡菜帶來不良風味的醇類物質，如3-甲基-1-丁醇，有辛辣而令人厭惡的不愉快氣味。異戊醇、芳樟醇及α-松油醇等對風味有積極影響的醇類物質含量在老壇水泡豇豆中更高，而產生不愉快氣味的3-甲基-1-丁醇則在接種泡豇豆中含量更高，且老壇水泡豇豆總醇相對含量明顯高于接種發酵泡豇豆。酸類物質含量較高時，對豇豆泡菜良好風味的形成有一定的積極作用。如含量最多的乙酸，一方面可以降低泡菜的pH值，促進泡菜的成熟，另一方面可以為泡菜增加柔和的酸味。酸類在泡菜的發酵過程中呈增長的趨勢，原因是在發酵過程中對異型乳酸發酵的菌株進行代謝的產物有一部分是乙酸。老壇水泡豇豆酸類物質和醇類含量大多高于接種泡豇豆，二者間發生反應生成的酯類物質也就更加豐富，對后期泡菜良好香味有積極作用。

其他物質方面，醛類物質的閾值低，雖含量不多，但對豇豆泡菜的風味有一定的影響。壬醛能賦予泡菜清香味，而糠醛、苯甲醛、3-甲氧基-丙醛則會給豇豆泡菜帶來刺激性氣味。老壇水泡豇豆中壬醛含量穩定，且刺激性醛類隨著發酵的進行而降低或消失，接種泡豇豆中刺激性醛類則隨著發酵時長的增加而增加。泡菜中的胺類物質是不良氣味的主要來源。接種泡菜中出現的胺類物質會影響泡菜的氣味。而含硫化合物的香味閾值極低，低濃度時呈現令人愉悅的香味的含硫化合物在高濃度時都具有強烈的令人厭惡的氣味。豇豆不屬于十字花科，本身不含硫[13]，而是中后期由于微生物發酵的作用產生的。兩種泡豇豆的含硫化合物均從第9天開始檢出，后期呈現上升趨勢。對比發現，老壇水泡豇豆含硫化合物的相對含量較低，對泡菜風味有積極作用。接種泡菜在發酵后期含硫化合物的相對含量增幅巨大，反而會帶來不良氣味，故在接種發酵過程中應該嚴格控制發酵時長。

4 關聯性分析

為了更好地揭示泡菜中揮發性組分與細菌群落之間的相互關系，采用冗余分析(RDA)方法，將泡菜樣品中的細菌群落特征作為物種，泡菜中特征揮發性組分作為環境因素，對兩個樣本進行RDA分析[14-15]，見圖5。

圖5 老壇水和接種發酵豇豆泡菜細菌群落 與揮發性成分RDA分析Fig.5 The RDA analysis of bacterial community and volatile components in laotan water fermented and inoculation fermented cowpea pickles

由圖5可知，與老壇水泡豇豆細菌群落相關性最大的揮發性成分是酯類和醇類，其次為酸類、酚類；與接種泡菜細菌群落相關性最大的揮發性成分是含硫化合物，其次是胺類。且兩種方式發酵的豇豆都呈現發酵前期微生物群落與醇類、酯類、酸類相關性較大，發酵后期細菌群落與醛類、含硫化合物、胺類相關性更大的特征，這與泡菜發酵前期主要進行異型乳酸發酵而后期主要進行同型乳酸發酵的特點相符。對在兩種泡豇豆中相對豐度排名前三的物種與揮發性物質相關性進行分析可知，乳桿菌屬(Lactobacillus)對揮發性風味成分的形成幾乎沒有影響，而弓形桿菌屬(Arcobacter)、片球菌屬(Pediococcus)對酯類、醇類、酸類、酚類揮發性物質的形成有影響，老壇水泡菜由于細菌群落豐富，對多種揮發性成分形成有利。而接種泡菜中乳桿菌屬在初始發酵時相對豐度達到93%左右，對接種泡菜揮發性成分的形成不利。

5 結論

本實驗通過對接種泡豇豆和老壇水泡豇豆發酵過程中的細菌群落和揮發性物質進行監測分析，探究發酵液中菌群組成和揮發性物質的差異性，并從微生物角度探究了揮發性物質存在差異性的原因。

采用PCR技術對從發酵液中提取的細菌群落進行擴增、分析，檢測出老壇水泡豇豆中細菌群落的豐富度明顯高于接種泡豇豆。老壇水泡豇豆在發酵過程中，主要細菌門類是厚壁菌門(Firmicutes)、Epsilonbacteraeota和變形菌門(Proteobacteria)，優勢菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)、弓形桿菌屬(Arcobacter)、片球菌屬(Pediococcus)及嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。接種泡豇豆在發酵過程中，菌種的相對單一，主要細菌門類是厚壁菌門(Firmicutes)，優勢菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)和鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)，少量嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。接種泡菜發酵過程中細菌群落結構更加穩定，也更容易實現工業化生產中品質的把控；老壇水泡菜發酵過程中細菌群落的組成變化較大，較難管控。

采用SPME-GC-MS聯用法對泡菜發酵過程中的揮發性物質進行分析，檢測出老壇水泡豇豆中揮發性成分約有41種，接種泡豇豆中檢測出的揮發性風味成分有36種，其中15種為老壇水泡豇豆獨有，11種為接種泡豇豆獨有。對泡菜風味有積極貢獻的醛類、酚類、酯類物質在老壇水泡豇豆中較多，而產生不愉快氣味的胺類物質和豐度高時產生不良風味的含硫化合物在接種泡豇豆中含量較高。接種發酵后期產生大量含硫化合物嚴重影響豇豆泡菜風味，證明接種泡菜發酵時間對風味影響相對較大，指導工業使用接種發酵時應該嚴格把控發酵時長，避免含硫化合物和胺類的大量產生。

通過對細菌群落和揮發性成分的RDA分析可知，酯類、醇類、酸類、酚類揮發性物質與老壇水泡豇豆中細菌相關性較為顯著，醛類、含硫化合物、胺類揮發性物質與接種泡菜中細菌相關性較為顯著。老壇水泡菜細菌群落豐富，弓形桿菌屬(Arcobacter)、片球菌屬(Pediococcus)對酯類、醇類、酸類、酚類揮發性物質的形成有影響，對應的揮發性成分的種類和含量更豐富。而接種泡菜以乳桿菌屬(Lactobacillus)為絕對優勢菌屬，該菌屬對揮發性物質的生成幾乎沒有貢獻。指導工業上采用接種發酵方法時，可以適當豐富菌種、調整菌群結構，例如無毒害作用且對風味有良好影響的片球菌屬，或是在后續生產中添加增香物質。