芥菜籽活性成分的制備及其抗氧化活性評(píng)價(jià)

彭紅梅，陳金鑫，屈艷秦，廖文

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，成都 611137；2.四川萬(wàn)格農(nóng)業(yè)科技有限公司，成都 610213)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們生活水平的提高，日常生活中對(duì)輻射源和致癌物的接觸越來(lái)越多，誘導(dǎo)人體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的自由基，導(dǎo)致人體抗氧化能力下降，引起人體衰老和其他慢性病[1]。芥菜籽粉碎后可以制成芥末，是日常生活中常用的調(diào)味品，添加至各種食物中，可形成獨(dú)特的食品風(fēng)味[2]。芥菜籽具有刺激性氣味，能夠?qū)θ梭w口腔及嗅覺(jué)系統(tǒng)產(chǎn)生刺激，改善食欲。芥菜籽中含有大約30%的蛋白質(zhì)，大約35%的脂肪，大約15%的碳水化合物，同時(shí)含有其他的微量元素及粗纖維。芥菜籽能夠有效地抑制細(xì)菌和真菌的繁殖，將其加入食物中，能夠延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期[3-4]。芥菜籽提取物經(jīng)過(guò)特殊處理后，能夠有效地降低多種癌細(xì)胞活力，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[5]。

本文以芥菜籽為研究對(duì)象，對(duì)芥菜籽中硫代葡萄糖苷、多酚和異硫氰酸酯等活性成分的制備工藝過(guò)程進(jìn)行分析，并對(duì)芥菜籽活性成分的抗氧化性進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

1 活性成分制備工藝

1.1 硫代葡萄糖苷的制備

硫代葡萄糖苷化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的抗氧化性。在進(jìn)行芥菜籽活性成分硫代葡萄糖苷的制備及含量測(cè)定時(shí)，選用氯化鈀法[6]。將芥菜籽樣品配制成濃度為0，0.1，0.5，0.75，1，1.25，1.5 μmol/mL的Sinigrin標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取2 mL樣品溶液，并加入4 mL分散劑和2 mL顯色劑，靜置1 h進(jìn)行顯色，在520 nm檢測(cè)吸光度。設(shè)定待測(cè)樣品為2 mL樣品溶液、4 mL分散劑和2 mL顯色劑的混合溶液，空白樣品為2 mL水、4 mL分散劑和2 mL水的混合溶液。將待測(cè)樣品和空白樣品的吸光度差值與溶液濃度的比值定義為硫代葡萄糖苷含量。

1.2 多酚的制備

在進(jìn)行芥菜籽活性成分多酚的制備及含量測(cè)定時(shí)，選用福林酚法[7]。將芥菜籽樣品配制成濃度為10，20，30，40，50，60，70，80 μg/mL的碳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1 mL樣品溶液加入試管中，并加入5 mL福林試劑，在室溫條件下避光靜置5 min，在765 nm處檢測(cè)溶液的吸光度。將待測(cè)樣品溶液的吸光度與溶液濃度的比值定義為多酚含量。

1.3 異硫氰酸酯的制備

異硫氰酸酯是一種油狀液體，易揮發(fā)，無(wú)色，沸點(diǎn)為150 ℃。在水溶液中，異硫氰酸酯與氫氧根離子反應(yīng)水解，能夠在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定保持[8]。異硫氰酸酯具有抑菌功效，能夠殺滅幽門(mén)螺桿菌，在食品中加入異硫氰酸酯能夠?qū)κ称菲鸬奖ｕr作用。

在進(jìn)行芥菜籽活性成分異硫氰酸酯的制備及含量測(cè)定時(shí)，稱(chēng)取0.5050 g芥菜籽樣品置于100 mL的容量瓶中，并加入二氯甲烷至刻度線(xiàn)，制備成標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱(chēng)取2.4952 g乙酸丁酯加入到100 mL的容量瓶中，并加入二氯甲烷至刻度線(xiàn)制備成內(nèi)標(biāo)溶液。分別取1，2，3，4，5，6，7，8，9 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入到10 mL離心管中，分別加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，并加入二氯甲烷保證離心管中溶液至10 mL刻度線(xiàn)。利用氣相色譜法測(cè)定離心管中溶液的色譜峰面積，譜峰面積與芥菜籽樣品質(zhì)量的比值可用來(lái)表示異硫氰酸酯含量。

2 活性成分抗氧化性評(píng)價(jià)方法

芥菜籽活性成分的抗氧化性包含體外抗氧化性及細(xì)胞抗氧化性。所謂體外抗氧化性指對(duì)氧化性自由基的清除能力及對(duì)氧化性離子的還原能力。細(xì)胞抗氧化性指試樣活細(xì)胞的存活率。

2.1 體外抗氧化性

氧化性自由基可接受芥菜籽活性成分提供的還原性自由基或電子，發(fā)生中和反應(yīng)，在進(jìn)行吸光度檢測(cè)時(shí)，吸光值減小，溶液顏色與發(fā)生中和反應(yīng)的程度有關(guān)，吸光度數(shù)值的大小可用來(lái)反映芥菜籽活性成分對(duì)氧化性自由基的清除能力。體外抗氧化性的測(cè)定評(píng)價(jià)分為氧化性自由基的清除及氧化性離子的還原。在進(jìn)行氧化性自由基的清除時(shí)，分別將芥菜籽活性成分與維生素C配制成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mg/mL的兩組溶液。取1 mL芥菜籽活性成分溶液，加入0.3 mL無(wú)水乙醇，制備成空白組溶液。取1 mL芥菜籽活性成分溶液，加入0.3 mL無(wú)水乙醇，并加入0.2 mL去離子水制備成對(duì)照溶液。取1 mL芥菜籽活性成分溶液，加入0.3 mL無(wú)水乙醇及0.2 mL含有氧化性自由基的水溶液，制備成待檢溶液。靜置30 min后，在517 nm條件下檢測(cè)溶液的吸光度，并按照公式進(jìn)行氧化性自由基清除率。

氧化性亞鐵離子能夠與芥菜籽活性成分溶液發(fā)生反應(yīng)，并呈現(xiàn)出淺藍(lán)色，光吸收值增強(qiáng)，根據(jù)吸光值變化程度來(lái)反映芥菜籽活性成分溶液對(duì)氧化性離子的清除能力。在進(jìn)行氧化性離子還原能力測(cè)定時(shí)，稱(chēng)取10 mg芥菜籽溶于去離子水中，制備成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mg/mL的溶液。取0.5 mL芥菜籽溶液加入試管中，加入0.2 mL濃度為0.3 mol/L的FeCl3與FeSO4混合溶液，制備成待檢測(cè)溶液。取0.5 mL芥菜籽溶液加入試管中，加入0.3 mL無(wú)水乙醇，制備成空白組溶液。取0.5 mL芥菜籽溶液加入試管中，加入0.3 mL無(wú)水乙醇和0.2 mL去離子水，制備成對(duì)照組溶液。靜置30 min后，在517 nm條件下檢測(cè)溶液的吸光度，并按照公式計(jì)算氧化性離子還原率。

式中：η表示氧化性自由基清除率或氧化性離子還原率，Ai表示待檢溶液吸光度，Aj表示空白組溶液吸光度，A0表示對(duì)照組溶液吸光度。

2.2 細(xì)胞抗氧化性

在進(jìn)行芥菜籽活性成分的抗氧化性測(cè)定時(shí)，將芥菜籽活性成分溶于二甲基亞砜中，制備成5，10，20，40，80 μg/mL的芥菜籽活性成分完全培養(yǎng)液。分別取10組1 mL密度為1×106個(gè)/mL細(xì)胞，加入9 mL細(xì)胞完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后吸附掉細(xì)胞培養(yǎng)液。其中一組分別加入不同濃度的芥菜籽活性成分完全培養(yǎng)液，制備成待檢組，另一組分別加入5，10，20，40，80 μg/mL的維生素C溶液，制備成對(duì)照組，培養(yǎng)12 h后，在490 nm條件下檢測(cè)溶液的吸光度，該吸光度即可反映細(xì)胞存活率。待檢測(cè)組溶液吸光度與對(duì)照組溶液吸光度的比值即表示芥菜籽活性成分溶液中細(xì)胞存活率。

式中：λ表示芥菜籽活性成分溶液中細(xì)胞存活率，Bi表示待檢溶液吸光度，B0表示對(duì)照組溶液吸光度。

3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，芥菜籽水溶液中的基本理化成分見(jiàn)表1。

表1 芥菜籽水溶液理化成分Table 1 The physicochemical components of mustard seed aqueous solution

根據(jù)以上芥菜籽活性成分制備方法，測(cè)定芥菜籽活性成分?jǐn)?shù)據(jù),見(jiàn)表2。

表2 芥菜籽活性成分含量Table 2 The content of active components in mustard seeds

芥菜籽活性成分對(duì)氧化性自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 芥菜籽活性成分對(duì)氧化性自由基的清除能力Fig.1 The scavenging ability of active components from mustard seeds on oxidative free radicals

由圖1中曲線(xiàn)可知，隨著芥菜籽活性成分溶液濃度的增加，芥菜籽活性成分對(duì)氧化性自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，與維生素C溶液相比，芥菜籽活性成分對(duì)氧化性自由基清除能力較弱。

芥菜籽活性成分溶液對(duì)氧化性離子的還原能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 芥菜籽活性成分對(duì)氧化性離子的還原能力Fig.2 The reducing ability of active components from mustard seeds on oxidative ions

由圖2中曲線(xiàn)可知，芥菜籽活性成分溶液對(duì)氧化性離子的還原能力逐漸增強(qiáng)，隨著芥菜籽活性成分溶液濃度的增加，芥菜籽活性成分溶液對(duì)氧化性離子還原能力的上升幅度逐漸變大。芥菜籽活性成分溶液對(duì)氧化性離子的還原能力可達(dá)到維生素C溶液對(duì)氧化性離子還原能力的60%。由此說(shuō)明芥菜籽活性成分溶液具有較強(qiáng)的氧化性離子還原能力。

芥菜籽活性成分中細(xì)胞存活率曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。

圖3 芥菜籽活性成分對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of active components from mustard seeds on cell survival rate

由圖3中曲線(xiàn)可知，芥菜籽活性成分溶液中細(xì)胞存活率均大于100%，由此說(shuō)明芥菜籽活性成分溶液中細(xì)胞存活能力大于對(duì)照組中細(xì)胞存活能力，表明芥菜籽活性成分溶液對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，從曲線(xiàn)中數(shù)值可以看出，當(dāng)芥菜籽活性成分溶液小于20 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活能力與對(duì)照組溶液中細(xì)胞存活能力基本相當(dāng)，隨著芥菜籽活性成分溶液濃度的增加，細(xì)胞存活能力逐漸增強(qiáng)。

4 結(jié)論

本文以芥菜籽為原料，對(duì)芥菜籽中的理化成分進(jìn)行提取，測(cè)定芥菜籽中硫代葡萄糖苷、多酚以及異硫氰酸酯等活性成分的含量，并對(duì)芥菜籽中活性成分的抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，芥菜籽活性成分對(duì)氧化性自由基具有一定的清除能力，但與維生素C溶液相比，芥菜籽活性成分對(duì)氧化性自由基清除能力較低；芥菜籽活性成分溶液具有較強(qiáng)的氧化性離子還原能力；芥菜籽活性成分溶液對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。