二至丸抑制皮膚黑素瘤細(xì)胞生長的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制及關(guān)鍵靶點(diǎn)探討*

陳 敬，楊 寧，張雅星，高秀梅

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，天津 300250；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

二至丸（EZP）是臨床常用的經(jīng)典名方，僅由女貞子（酒蒸）和墨旱蓮 2味藥（1∶1）組成，可單獨(dú)使用，也可隨證加減。EZP是平肝補(bǔ)腎之良劑，主治肝腎陰虛證，研究證實(shí)其藥理作用包括調(diào)節(jié)免疫力，抑制腫瘤生長，抗炎，抗氧化，抗衰老等[1-3]。中醫(yī)認(rèn)為肝腎二臟在皮膚病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，臨床實(shí)踐中注重對肝腎的調(diào)補(bǔ)，以期對皮膚病的管理取得良好的效果。EZP臨床用于多種腫瘤的防治[4-5]，該藥有多維度的干預(yù)腫瘤的機(jī)制，其中之一可能與上調(diào)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平有關(guān)，NF-κB與TNF-α屬于上下游關(guān)系，而NF-κB信號通路在黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著分子開關(guān)樣重要的作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此EZP也用于陰虛型皮膚黑素瘤（SKCM）患者的調(diào)護(hù)[6-8]。文章采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對EZP的有效成分抑制SKCM細(xì)胞生長的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 二至丸藥物有效成分篩選 女貞子和墨旱蓮藥物有效成分的篩選，利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平 臺 （TCMSP），（http：//tcmspw．com/tcmsp．php），篩選條件設(shè)定為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性指數(shù)（DL）≥0．18%。同時(shí)，在TCMSP平臺獲取EZP有效成分對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，并在UniProtKB 數(shù)據(jù)庫（http：//www．uniprot．org/）檢索出藥物靶點(diǎn)所對應(yīng)的基因，檢索條件為人源基因（Organism：Homo sapiens）。

1.2 皮膚黑素瘤相關(guān)的靶點(diǎn)獲取 在GEO數(shù)據(jù)庫獲得黑素瘤細(xì)胞與黑素細(xì)胞的差異基因表達(dá)，（https：//www．ncbi．nlm．nih．gov/geo/，Series：GSE122910，Samples：GSM3487958，GSM3487959，GSM3487960，GSM3487961，GSM3487962，GSM3487963，GSM3487964，GSM3487965，GSM3487966，GSM3487967），檢索條件為人源基因。認(rèn)為P value＜0．005并|log 2（fold change）|＞1的基因具有顯著表達(dá)差異，是SKCM相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 建立二至丸對黑素瘤細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用CytoScape3．7．2，對 EZP“成分-靶點(diǎn)基因”“靶點(diǎn)基因-黑素瘤”的數(shù)據(jù)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?在CytoScape中應(yīng)用BisoGenet程序，建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI network），將EZP推定的靶點(diǎn)和SKCM的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行可視化展示。數(shù)據(jù)庫來源于相互作用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（DIP），交互數(shù)據(jù)集的生物通用存儲(chǔ)庫（BioGRID），人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫（HPRD），完整的分子相互作用數(shù)據(jù)庫（IntAct），分子相互作用數(shù)據(jù)庫（MINT），生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（BIND）。應(yīng)用CytoNCA軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觯行亩龋―C）在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和系統(tǒng)藥理學(xué)研究中代表了拓?fù)渲匾裕ㄟ^計(jì)算DC篩選交互網(wǎng)絡(luò)中具有拓?fù)渲匾缘墓?jié)點(diǎn)，篩選出樞紐基因（Hub genes）。

1.5 Hub genes的生存分析 利用基因表達(dá)譜交互分析數(shù)據(jù)庫（GEPIA），對按照DC篩選出的前10位的Hub genes進(jìn)行驗(yàn)證。方法為全局的生存分析（overall survival，OS），群截?cái)酁橹形粩?shù)，數(shù)據(jù)集為SKCM，繪制箱線圖（Boxplot）、分期圖（stage plot）和生存圖（survival plot）。

1.6 差異基因GO和KEGG富集分析、KEGG網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過基因本體（GO）分析EZP影響SKCM的生物學(xué)通路，通過京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析EZP影響SKCM的代謝通路。應(yīng)用DAVID 生物信息學(xué)資源（https：//david．ncifcrf．gov）進(jìn)行差異基因的富集分析，應(yīng)用功能注釋對黑素瘤細(xì)胞的差異基因進(jìn)行分析，選擇官方基因名稱（OFFICIAL_GENE_SYMBOL），默認(rèn)人類物種，并進(jìn)行生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）和KEGG途徑富集分析。篩選條件為P value＜0．05，圖中僅顯示前20個(gè)富集結(jié)果。應(yīng)用CytoScape構(gòu)建KEGG網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 二至丸有效成分 在OB≥30%，并DL≥0．18的條件下，獲得EZP有效成分21種，其中女貞子有效成分13種，墨旱蓮有效成分10種，兩味藥物共有的有效成分2種，分別為MOL000006木犀草素（luteolin）和 MOL000098槲皮素（quercetin），兩者的OB 值分別為 36．16 和 46．43，DL 分別為 0．25 和0．28，見表1。共獲得藥物靶點(diǎn)蛋白214個(gè)，得到人類靶點(diǎn)基因190個(gè)。

2.2 皮膚黑素瘤相關(guān)的靶點(diǎn) 共獲得1889個(gè)SKCM相關(guān)靶點(diǎn)，并通過圖1來顯示差異表達(dá)基因的分布，圖中紅色點(diǎn)代表SKCM上調(diào)的差異表達(dá)基因的分布，綠色點(diǎn)代表SKCM下調(diào)的差異表達(dá)基因的分布。圖2顯示黑素瘤細(xì)胞（腫瘤組，Tumor，T）與黑素細(xì)胞（觀察組，Control，C）的差異表達(dá)基因，紅色代表上調(diào)的基因，綠色代表下調(diào)的基因。

表1 二至丸有效成分（OB≥30%，DL≥0.18）

圖1 黑素瘤中差異基因表達(dá)分布

2.3 二至丸對黑素瘤細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) EZP有效成分與SKCM靶點(diǎn)基因作用的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，節(jié)點(diǎn)共32個(gè)，其中有效成分共11種（綠色代表墨旱蓮的有效成分4種，粉色代表女貞子的有效成分5種，藍(lán)色為兩味藥物共有的成分2種），可調(diào)控黑素瘤細(xì)胞的基因（黃色），共21個(gè)。邊線表示有效成分與靶點(diǎn)基因之間的相互作用，共產(chǎn)生邊線40條。產(chǎn)生邊線最多前3位有效成分，分別是槲皮素17條，木犀草素6條，此2者為女貞子與墨旱蓮共有的成分，山奈酚（kaempferol，MOL000422）6 條，此為女貞子中成分。靶點(diǎn)基因中PTGS1含邊線10條，DPP4含邊線5條，細(xì)胞核因子κB抑制劑α（NFKBIA）含邊線2條，這3個(gè)靶點(diǎn)基因的邊線均與女貞子與墨旱蓮的共有成分木犀草素和槲皮素產(chǎn)生相互作用。

圖3 二至丸有效成分與黑素瘤靶點(diǎn)基因作用的網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)建立及拓?fù)浞治?為了揭示EZP對SKCM的潛在作用機(jī)制，將EZP推定靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)和SKCM相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)合并，確定EZP對SKCM的候選靶點(diǎn)，共得出631個(gè)節(jié)點(diǎn)，見圖4。應(yīng)用DC篩選后，平均度值為22．3708，最大度值為178，表2列出了前10位的樞紐基因。

2.5 生存分析 分別對 NFKBIA，TP53，NTRK1，HSP90AA1，UBC，EP300進(jìn)行單因素生存分析，發(fā)現(xiàn)NFKBIA在腫瘤組（T）是低表達(dá)，在正常人群組（Normal，N）是高表達(dá)，見圖 5。同時(shí)，NFKBIA 在腫瘤的 0、1、2、3、4 期，表達(dá)差異變化不顯著，見圖 6。繪制生存圖發(fā)現(xiàn)NFKBIA低表達(dá)組生存較差，與正常組比較P＜0．005，見圖7。而 TP53，NTRK1，HSP90AA1，UBC，EP300的表達(dá)差異，均未對存活期產(chǎn)生明顯影響。

圖4 二至丸與黑素瘤的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

表2 二至丸治療黑素瘤的樞紐基因（前10位）

圖5 腫瘤組和正常組NFKBIA的表達(dá)

2.6 差異基因GO和KEGG富集分析、KEGG網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 GO富集分析EZP影響SKCM的生物學(xué)通路，圖中縱坐標(biāo)是GO的名稱，橫坐標(biāo)是富集在每一個(gè)GO上基因的數(shù)目，柱子越長代表富集在GO上基因的數(shù)目越多，柱子顏色代表富集的顯著性，越紅說明GO在這個(gè)基因上富集越顯著。富集最顯著的生物過程是對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide），對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin），見圖 8。富集最顯著的細(xì)胞組成是膜筏（membrane raft），見圖9。富集最顯著的分子功能是趨化因子活性（chemokine activity），趨化因子受體結(jié)合（chemokine receptor binding），CXCR 趨化因子結(jié)合（CXCR chemokine receptor binding），細(xì)胞因子活性（cytokine activity），細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding），見圖10。通過KEGG途徑分析，確定EZP在治療SKCM過程中顯著影響的代謝途徑。圖中縱坐標(biāo)是KEGG的名稱，橫坐標(biāo)是基因的比例，圓圈的大小代表富集在每一個(gè)通路上基因的數(shù)目，圓圈越大說明富集在通路上的基因數(shù)目越多，圓圈的顏色代表富集的顯著性，圓圈越紅說明在這條通路上富集越顯著。前四位分別為腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway），白介素-17信號通路（IL-17 signaling pathway），趨化因子信號通路（Chemokine signaling pathway），細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction），見圖 11。基因-通路網(wǎng)絡(luò)分析通過KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)可視化，即KEGG與基因之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，外圈是通路，里面是基因，連線表示基因?qū)儆谶@個(gè)通路，基因和通路圖形的大小代表了連接節(jié)點(diǎn)的數(shù)目。基因中第一位的是NFKBIA，通路中第一位是TNF信號通路，見圖12。

3 討論

SKCM是一種侵襲性皮膚癌，并且具轉(zhuǎn)移性，中位生存率約為6個(gè)月，且發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，在中國每年新發(fā)病例約2萬例左右，轉(zhuǎn)移性黑素瘤預(yù)后極差，5年生存率低于10%[9-10]。SKCM起源于位于表皮基底層的黑素細(xì)胞，在正常的生理環(huán)境中，黑素細(xì)胞的生長受角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)，由于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的關(guān)鍵基因突變，黑素細(xì)胞無法對角質(zhì)形成細(xì)胞的調(diào)節(jié)信號做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，最終導(dǎo)致異常生長。近年來，盡管在黑素瘤有效治療方法的發(fā)展方面取得了重大突破，但疾病的不可治愈性仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[11]。而且，許多傳統(tǒng)的抗癌療法面臨著許多問題，如多藥耐藥性、抵達(dá)癌組織前的全身分布和毒副作用等，臨床上需要不斷探索黑素瘤的管理方法，以期延長患者的生存時(shí)間。中草藥具有廣泛的藥理作用，應(yīng)用于各種慢性病和腫瘤的治療，它能影響多個(gè)分子靶點(diǎn)和通路，在臨床中顯示了良好的效果。

圖6 NFKBIA在黑素瘤不同臨床分期的表達(dá)

圖7 NFKBIA對生存周期的影響

圖8 二至丸影響黑素瘤的GO富集-生物學(xué)過程

圖9 二至丸影響黑素瘤的GO富集-細(xì)胞組成

圖10 二至丸影響黑素瘤的GO富集-分子功能

圖11 二至丸影響黑素瘤的KEGG富集

圖12 二至丸影響黑素瘤的KEGG網(wǎng)絡(luò)

二至丸出自明代吳旻輯的《扶壽精方》，其性平和、偏寒，歸肝、腎經(jīng)，其補(bǔ)而不膩，為平補(bǔ)佳品。臨床廣泛應(yīng)用于證屬肝腎虛證的多種疾病，也常用于緩解亞健康的相關(guān)癥狀，且鮮見不良反應(yīng)的報(bào)道。EZP應(yīng)用于包括SKCM等多種腫瘤的治療，取得較好臨床療效，且對EZP藥理作用的研究也表明它具有良好的抗腫瘤、抗衰老和抗炎等作用。

中醫(yī)藥是個(gè)高度復(fù)雜的系統(tǒng)，含有大量的化學(xué)成分，本研究嘗試通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討EZP治療SKCM的有效化學(xué)成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。

EZP中3種有效成分與SKCM靶點(diǎn)基因作用密切，其中木犀草素和槲皮素是女貞子和墨旱蓮兩藥共有成分，具有較高的生物利用度；山奈酚來源于女貞子，可能是一種有效的免疫抑制劑，可減少有害的免疫反應(yīng)，包括慢性炎癥和自身免疫。

本研究得到的EZP對抗SKCM的候選目標(biāo)，按照DC篩選樞紐基因，發(fā)現(xiàn)列第1位的NFKBIA在腫瘤組是低表達(dá)。NFKBIA被認(rèn)為是1種抑癌基因，是避免NF-κB激活的重要抑制劑。研究表明NF-κB在SKCM細(xì)胞中被高度激活[12]，NF-κB特異性抑制劑具有顯著的抑制鼠黑素瘤B16細(xì)胞生長及VEGF表達(dá)的作用[7]，且具有顯著的抑制人黑素瘤A375細(xì)胞生長及PCNA表達(dá)的作用[8]，是1種有潛力的抑制黑素瘤增殖的藥物，阻斷NF-κB和ERK兩條信號通路對A375細(xì)胞具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，兩者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)[13]。難以控制的黑素瘤細(xì)胞NF-κB通路持續(xù)激活[14]，NFKBIA低表達(dá)顯著縮短患者生存時(shí)間，且NFKBIA在黑素瘤各個(gè)臨床分期中持續(xù)低表達(dá)，推測EZP可用于SKCM各期的管理，通過改善NFKBIA低表達(dá)，延長生存年限。

KEGG富集顯示，EZP影響黑素瘤細(xì)胞生長的代謝通路主要為TNF信號通路，IL-17信號通路，趨化因子信號通路，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等。TNF-α具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，在小鼠黑素瘤模型研究中發(fā)現(xiàn)，它能夠促進(jìn)腫瘤的廣泛壞死[15]，多項(xiàng)臨床研究將TNF-α應(yīng)用于惡性黑色素瘤的肢端灌流，獲得較好效果。NF-κB是IL-17信號通路下游主要的亞通路，通路持續(xù)活化可能是疾病持續(xù)存在的原因之一[16]。

綜上，本研究對二至丸抑制皮膚黑素瘤細(xì)胞生長的分子機(jī)制和靶點(diǎn)進(jìn)行了基本預(yù)測，為后期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證提供了理論基礎(chǔ)。