皮質醇固相放射免疫分析方法的建立

劉洪奎

（北京北方生物技術研究所有限公司，北京 100076）

1 材料與方法

1.1 材料

主要儀器與試劑

伽馬放射免疫計數器為安徽中科中佳科學儀器有限公司產品；

皮質醇抗原、兔抗-皮質醇抗體、放射性核素Na125I溶液、驢抗兔血清、聚苯乙烯試管、皮質醇液相RIA藥盒均由北京北方生物技術研究所有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 驢抗兔抗體親和純化

利用本公司專利技術，將驢抗兔血清進行親和純化，得到親和純驢抗兔抗體。

1.2.2 標準品配制

用標準品稀釋液將皮質醇配制成系列濃度點，以0.5 mL每瓶分裝，4℃保存。

1.2.3 皮質醇抗體包被管制備

用二抗包被液將驢抗兔配成合適濃度后進行第一層包被，再用一抗包被液將皮質醇抗體配成合適濃度后進行第二層包被，最后加入封閉液抽干干燥，4℃保存。

1.2.4 125I-皮質醇標記抗原制備

皮質醇標記抗原采用氯胺-T法進行皮質醇標記抗原的125I標記，檢驗合格后按要求分裝，4℃保存。

1.2.5 放免分析程序與統計學方法

取20 μl皮質醇標準品或樣品加入抗體包被管中，加入200 μl125I-皮質醇標記抗原，37℃水浴1小時，吸棄反應液并洗滌一次，測定各管的CPM放射性計數。以標準品濃度為橫坐標，以放射性計數值為縱坐標，以Logit-log 直線回歸制作標準曲線，最后計算出樣品中皮質醇的含量。

2 結 果

2.1 方法學優化

參照本公司皮質醇液相放射免疫分析藥盒的經驗方法，通過固定125I-皮質醇標記抗原的量來選擇抗體包被管的包被濃度。本方法學反應溫度采用37℃溫育，通過研究反應時間確保反應達到平衡狀態。

2.1.1 驢抗兔抗體濃度的選擇

將純化的驢抗兔抗體稀釋成5個濃度，包被于聚苯乙烯空白試管；再包被足量的抗體。實驗結果表明：當驢抗兔抗體濃度達到20 μg/mL時，可以滿足實驗需求。

2.1.2 皮質醇抗體滴度的選擇

將抗體稀釋成5個滴度，進行包被，實驗結果表明：當抗體滴度達到1：3000時，處于比較合適的位置，最終選擇抗體包被滴度為1：3000。

2.1.3 反應時間的選擇

選擇五個反應時間進行37℃溫育。實驗結果表明：當反應時間達到60 min時達到平衡點，即反應條件為37℃溫育1 h。

2.2 方法學鑒定

2.2.1 標準曲線

通過方法學建立，得到的皮質醇固相放射免疫分析方法的標準曲線。測量范圍為10～500 ng/mL，標準曲線方程為y=-1.61，x=-0.06，r=0.999。

2.2.2 靈敏度

測定20個“零”標準的計數值，求出X-2SD值,并將此值代入標準曲線方程，計算出對應的濃度為0.38 ng/mL，即為此方法學的靈敏度。

2.2.3 精密度

對2份含低、高濃度的血清樣品分別在一次實驗中平行多管測定和在不同實驗中重復測定，得到批內變異系數為3.20%～4.53%，批間變異系數為4.84%～6.76%，可見本方法的精密度較好，符合免疫分析的要求。

2.3 方法學比較

用本方法分別與液相RIA方法同時測量93份血清樣品，對樣品值進行比較?？芍痉椒ㄅc液相RIA方法的相關性方程為y=0.984x+2.089，相關系數r=0.991。說明本方法與市場上合格的液相放射免疫分析方法具有良好的相關性。

2.4 穩定性

將皮質醇RIA藥盒置于37℃ 0、1、3、7、10d進行放射免疫分析考查其穩定性。可知皮質醇RIA藥盒在37℃存放10天能保持良好的穩定性。

3 討 論

皮質醇對鑒別診斷Addison和Cushing病，垂體功能減退癥，腎上腺增生，糖尿病和癌癥非常有等均具有重大的臨床意義。以固相RIA技術（包被管分離）取代傳統的液相RIA技術（分離劑法分離），使得操作更加簡便快速，可適合大量臨床樣品的檢測，尤其是以洗滌代替離心，不僅降低了非特異性結合，提高了精密度和準確性，更能推動RIA朝自動化操作發展。