電場(chǎng)技術(shù)對(duì)于熱帶水果保鮮機(jī)理影響研究

任 猛 左秋杰

（長(zhǎng)虹美菱股份有限公司 合肥 230001）

引言

前期研究發(fā)現(xiàn)，電場(chǎng)條件下保鮮效果存在明顯差異，具體表現(xiàn)在：①不同電場(chǎng)條件下保鮮效果的差異；②不同代謝類型果蔬電場(chǎng)作用效果的差異，主要表現(xiàn)在呼吸躍變型和非呼吸躍變型水果。而根據(jù)文獻(xiàn)以及資料搜集，并無(wú)相關(guān)的研究分析。

果蔬作為活體，需要進(jìn)行一系列的代謝維持機(jī)體正常的生活活動(dòng)，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成代謝和消耗代謝，而這些代謝活動(dòng)強(qiáng)弱均由相關(guān)的酶所催化。根據(jù)生物學(xué)遺傳知識(shí)，酶由基因編碼控制，因此果蔬代謝的相關(guān)變化其實(shí)就是代謝途徑中相關(guān)酶活性及其含量發(fā)生變化的結(jié)果，所有的生命活動(dòng)均由基因所控制[1]。從基因?qū)用娼馕鲭妶?chǎng)處理的保鮮機(jī)理，根據(jù)電場(chǎng)處理對(duì)水果基因表達(dá)的影響進(jìn)行研究，找到電場(chǎng)處理對(duì)于熱帶水果代謝影響等更深層次的機(jī)理，能夠更好解釋電場(chǎng)對(duì)于熱帶水果作用的機(jī)理。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析不同電場(chǎng)強(qiáng)度下對(duì)于呼吸躍變型果蔬乙烯的釋放以及呼吸強(qiáng)度的影響，確定電場(chǎng)適宜的催熟處理?xiàng)l件。實(shí)現(xiàn)電場(chǎng)技術(shù)優(yōu)化的同時(shí)，解決熱帶水果存儲(chǔ)難的問(wèn)題，為熱帶水果在冰箱中的保鮮提供技術(shù)以及理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料選擇及依據(jù)

選擇香蕉作為電場(chǎng)處理的研究材料，電場(chǎng)為高壓靜電場(chǎng)，電場(chǎng)強(qiáng)度為30～200 V內(nèi)。由于香蕉作為熱帶水果，具有可靠的基因組信息資源可供利用，便于后續(xù)的基因信息挖掘。電場(chǎng)強(qiáng)度選擇根據(jù)前期保鮮效果試驗(yàn)結(jié)果確定。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

美菱BCD-481WQ3M冰箱2臺(tái)，高壓靜電場(chǎng)模塊、氣相色譜儀等。

1.3 分析方法

測(cè)定電場(chǎng)條件下香蕉代謝基因表達(dá)差異性，結(jié)合主要代謝指標(biāo)（酶活、丙二醛、乙烯）數(shù)據(jù)，分析電場(chǎng)熱帶水果保鮮的機(jī)理。

2 試驗(yàn)方法

2.1 基因分析方法

選擇香蕉作為試驗(yàn)材料，通過(guò)電場(chǎng)處理，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。測(cè)試樣品分別存儲(chǔ)在適宜溫度（12 ℃）條件下設(shè)有電場(chǎng)模塊的冰箱以及對(duì)照冰箱。每?jī)商鞙y(cè)試乙烯釋放量，在最佳效果的時(shí)間點(diǎn)取樣（根據(jù)對(duì)照與試驗(yàn)組數(shù)據(jù)出現(xiàn)明顯差異判斷），提取樣品總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，統(tǒng)計(jì)差異基因，結(jié)合代謝通路進(jìn)行分析。

2.2 酶活性測(cè)試

2.2.1 酶液的提取

稱取樣品10 g預(yù)冷研磨，加入20 mL 經(jīng)預(yù)冷處理的95 %乙醇，低溫靜置10 min后，低溫4 ℃下12 000 r/min離心20 min，去除上清液。重復(fù)上述操作后，加入5 mL預(yù)冷的1.8 mol/L NaCl提取緩沖溶液（50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值為5.5），4 ℃條件下放置20 min，離心后收集上清液，于 4 ℃ 保存。

2.2.2 多聚半乳糖醛酸酶[2]活性測(cè)定

取2支試管，均加入1 mL 50 mmol/L，pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和0.5 mL 10g/L多聚半乳糖醛酸溶液（1.0 g多聚半乳糖醛酸溶于100 mL 50 mmol/L pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液），1支試管加入0.5 mL酶提取液，另1支加入0.5 mL經(jīng)煮沸5 min的酶提取液作為對(duì)照并標(biāo)記，混勻后在37 ℃保溫1 h，保溫后迅速加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸 （DNS），沸水浴 5 min，取出后經(jīng)流水冷卻，蒸餾水稀釋至25 mL，在540 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算酶活，公式如下：

式中：

M′—從標(biāo)準(zhǔn)曲線查的葡萄糖質(zhì)量，mg；

V—樣品提取液總體積，mL；

VS—測(cè)定時(shí)索取樣品提取液體積，mL；

T—酶促反應(yīng)時(shí)間，h；

M—樣品質(zhì)量，g。

2.2.3 羧甲基纖維素酶活性測(cè)定

取2支試管，每支加入1.5 mL底物（底物配制:稱取1.0 g羧甲基纖維素鈉溶于 pH值為5.0的 50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，定容到100 mL），1支試管加入0.5 mL酶提取液，另1支加入0.5 mL經(jīng)煮沸5 min的酶提取液作為對(duì)照，混勻后在37 ℃保溫1 h，保溫后迅速加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS），沸水浴 5 min，取出后經(jīng)流水冷卻，蒸餾水稀釋至25 mL，在540 nm處測(cè)定吸光度。

計(jì)算公式：

式中：

m′—從標(biāo)準(zhǔn)曲線查的葡萄糖質(zhì)量，mg；

V—樣品提取液總體積，mL；

VS—測(cè)定時(shí)索取樣品提取液體積，mL；

T—酶促反應(yīng)時(shí)間，h；

M—樣品質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)序樣品乙烯釋放量的測(cè)定

從表1中可以看出，香蕉從第4 天開始乙烯釋放量開始出現(xiàn)差異，第6天的差異比較顯著，顯示了通過(guò)抑制乙烯達(dá)到保鮮的效果，由此選擇最佳電場(chǎng)強(qiáng)度處理6 d的香蕉作為測(cè)序的樣品。

3.2 香蕉Unigene功能注釋及相關(guān)性分析

根據(jù)測(cè)試分析，71 139個(gè)unigenes被成功注釋。Unigenes有48.72 %與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)一致，有30.76 %的unigenes得到GO注解，分別有20.77 %，11.88 %和31.91 %的 unigenes得到KEGG，COG，Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋。香蕉unigenes功能注釋圖見圖1。

通過(guò)樣品之間相關(guān)性的分析（如圖2），可觀察組內(nèi)樣品之間的生物學(xué)重復(fù)性。同時(shí)組內(nèi)樣品相對(duì)組間樣品的相關(guān)系數(shù)越高，獲得的差異代謝物越可靠，且驗(yàn)證了試驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性。如圖3～5所示，可以看到相關(guān)系數(shù)均在0.92以上，說(shuō)明測(cè)定的樣本穩(wěn)定性較好，獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可以進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

表1 香蕉在不同電場(chǎng)強(qiáng)度的乙烯釋放量

圖1 香蕉unigenes功能注釋圖

圖2 香蕉相關(guān)性分析

圖3 香蕉差異基因統(tǒng)計(jì)圖

圖4 差異基因富集分析

3.3 差異基因的篩選

電場(chǎng)處理果實(shí)中有150個(gè)基因的表達(dá)水平受到顯著影響，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這150個(gè)基因中有127個(gè)基因的表達(dá)量增加了，而剩下的23個(gè)基因表達(dá)量下降了，如圖3～5所示；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這有150受到電場(chǎng)處理影響的基因里面有3個(gè)與乙烯有關(guān)，7個(gè)與細(xì)胞壁代謝有關(guān)以及32個(gè)與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和代謝有關(guān)（見表2），這些基因的表達(dá)變化會(huì)影響到電場(chǎng)處理后的果實(shí)乙烯生成情況，果實(shí)軟化和細(xì)胞膜的透性或者衰老特性。除此之外，其他受到電場(chǎng)處理的差異表達(dá)基因大多是和蛋白質(zhì)的折疊和加工相關(guān)，這些蛋白與果實(shí)的保鮮關(guān)系不大。

表2 與乙烯，細(xì)胞壁以及細(xì)胞膜相關(guān)的差異基因統(tǒng)計(jì)表

圖5 植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝通路圖

考慮到上述差異基因大部分集中于生物體的蛋白質(zhì)加工和代謝過(guò)程，這些與保鮮關(guān)系不大。參考差異基因以及代謝通路，結(jié)合乙烯釋放量的差異，電場(chǎng)處理導(dǎo)致了香蕉中的乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵酶編碼基因EIN3受到影響，抑制乙烯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，阻斷乙烯在細(xì)胞間的傳遞，使乙烯不能和乙烯受體結(jié)合，也就是細(xì)胞不能感受到乙烯信號(hào)，最終延緩水果的成熟衰老過(guò)程；另外，在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在油菜素類固醇正常生成后，油菜素類固醇作為一種信號(hào)調(diào)控關(guān)鍵酶基因TCH4（木葡聚糖:木葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶）被電場(chǎng)處理后顯著上調(diào)表達(dá)，也就意味著木葡聚糖：木葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性得到增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞壁半纖維素類多糖—木葡聚糖的生成，促進(jìn)細(xì)胞壁的生成和活性，從而控制細(xì)胞增大，保持細(xì)胞硬度，維持水果新鮮度。電場(chǎng)施加之后，作為一種信號(hào)進(jìn)入植物MAPK信號(hào)通路中，調(diào)控信號(hào)通路中的關(guān)鍵酶的基因RBOH（呼吸爆發(fā)氧化酶）上調(diào)表達(dá)，RBOH作為一種呼吸作用氧化酶，以氧氣和過(guò)氧化氫為受體，可以消耗細(xì)胞內(nèi)的氧化物質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)的活性氧的穩(wěn)態(tài)，防止細(xì)胞氧化包括細(xì)胞膜的過(guò)氧化，維持細(xì)胞內(nèi)正常氧化還原狀態(tài)，避免細(xì)胞膜的破壞，維持細(xì)胞活性，延緩了植物衰老，維持良好品質(zhì)。

3.4 生理指標(biāo)的測(cè)試

上述試驗(yàn)從基因水平解析了電場(chǎng)處理對(duì)果實(shí)保鮮相關(guān)代謝途徑中關(guān)鍵基因的影響，包括乙烯生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞壁的代謝等。生理指標(biāo)測(cè)試從細(xì)胞和蛋白水平了解電場(chǎng)處理對(duì)細(xì)胞壁代謝和細(xì)胞衰老的影響。其中細(xì)胞壁代謝影響果實(shí)的軟化，細(xì)胞電導(dǎo)率和氧化能力反應(yīng)細(xì)胞的衰老水平，也間接反應(yīng)果實(shí)的保鮮效果。其中細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶選擇了多聚半乳糖醛酸酶和纖維素酶；細(xì)胞衰老相關(guān)指標(biāo)選擇丙二醛含量指標(biāo)測(cè)定。

由表3可以看出，香蕉在電場(chǎng)中其多聚半乳糖醛酸酶，纖維素酶活性均低于對(duì)照組香蕉相應(yīng)酶的活性，說(shuō)明30～200 V電場(chǎng)可以有效抑制這兩種細(xì)胞壁酶的活性，抑制了細(xì)胞壁的降解，延緩果實(shí)軟化；香蕉在電場(chǎng)強(qiáng)度中丙二醛含量和電導(dǎo)率也低于對(duì)照組，說(shuō)明電場(chǎng)可以有效抑制細(xì)胞膜過(guò)氧化，降低膜的通透性，保持細(xì)胞活性，延緩衰老過(guò)程，保持水果新鮮度，與轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析相吻合，香蕉生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果均說(shuō)明電場(chǎng)對(duì)水果的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜不產(chǎn)生傷害，維持細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性和功能，延緩果實(shí)軟化和衰老過(guò)程，保持果實(shí)新鮮。

表3 香蕉電場(chǎng)處理第6天生理指標(biāo)測(cè)定表

4 結(jié)論

綜合得知，電場(chǎng)保鮮對(duì)于水果的保鮮機(jī)理是通過(guò)抑制乙烯信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程關(guān)鍵基因，抑制乙烯在細(xì)胞內(nèi)的傳遞，使乙烯不能與受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)果蔬催熟過(guò)程抑制的同時(shí)，調(diào)控細(xì)胞壁多糖代謝過(guò)程，調(diào)控與細(xì)胞壁相關(guān)酶基因，實(shí)現(xiàn)酶活性的調(diào)節(jié)，具體表現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞壁的生成，維持細(xì)胞活性。