超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法測定狗肉中的氯化琥珀膽堿

氯化琥珀膽堿（Succinylcholine Chloride，SUC）是一類肌肉松弛藥，主要作為獸藥或臨床手術麻醉誘導劑等用途[1]。SUC中毒的病理學現象一般表現為急性的肺水腫、肺淤血，嚴重者甚至會猝死[2]。由于SUC具有一定的毒性，因此被一些不法分子用于制作“毒狗針”盜殺家犬[3]，而家犬體內殘留的SUC則一同流入市場，影響人體的健康。因此建立有效的檢測手段，對保護人體的健康安全尤為重要。

有相關學者對SUC的檢測方法做了大量研究，如紅外光譜法[4]、酶電極法[5]和薄層色譜法[6]，但紅外光譜法和薄層色譜法操作煩瑣，且只適合于純品的檢測，酶電極法在一般實驗室中，適用性較低。近年來SUC主要的檢測方法集中于離子色譜法[7-8]和液相色譜-三重四極桿質譜法[9-12]。本文基于固相萃取凈化，建立了測定狗肉中SUC的超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜分析方法，可精確測定目標物一級離子和二級離子的質荷比，準確定性、定量，對市場上的不法行為提供有效的監督手段。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

氯化琥珀膽堿，純度大于98.5%，購自上海安譜公司；甲酸、甲醇、乙腈、氨水，HPLC級，美國Thermo Fisher公司；Hydrophile Lipophilic Balance HLB，Weak Cation Exchange Chromatography WCX小柱，500 mg，6 mL，CNW，購自上海安譜公司。

1.2 儀器與設備

飛行時間質譜，AB Triple TOF5600+，美國AB SCIEX公司；液相色譜，島津LC-30AD，日本島津公司；超純水系統，Milli-Q Advantage A10，法國Merck Millipore公司；離心機，4k-15離心機，德國Sigma公司；搖床：Heidolph Promax 2020，德國Heidolph公司。

1.3 實驗條件

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱量氯化琥珀膽堿標準品0.100 0 g于100 mL容量瓶中，用少量乙腈超聲溶解，再用乙腈定容至刻度線，該標準溶液濃度為1 000 mg·L-1。

將上述標準溶液，先用乙腈稀釋至10 mg·L-1，再使用空白基質液逐級稀釋，配制成濃度為1 μg·L-1、2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1和100 μg·L-1的標準曲線系列溶液。

1.3.2 前處理方法

①狗肉樣品去皮去骨，取肉均質，于-4 ℃保存。②稱取1.0 g解凍均質樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 30%乙腈水溶液，渦旋振搖30 s，然后置于搖床中水平振搖提取15 min。以10 000 r·min-1離心5 min，轉移上清液于另一50 mL離心管中，再用10 mL 30%乙腈水溶液提取1次。合并兩次提取液，用氨水調節pH值至9.0。③固定WCX固相萃取小柱后，先用4 mL甲醇上柱活化，待甲醇流干后，迅速加入4 mL氨水（pH=9.0），待液面下降至填料層時，加入4 mL提取液，控制流速每秒1～2滴，若出現堵塞情況可加壓，待流干后加入4 mL 50%甲醇水進行淋洗，減壓抽干小柱，最后用2 mL甲酸乙腈水溶液（1/8/1,V/V/V）洗脫，洗脫液過0.22 μm有機濾膜上機。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，3 μm)；進樣量為10 μL；柱溫為 40 ℃；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；洗脫模式：梯度洗脫模式；洗脫程序：0～2 min，5%A；2～6 min，5%→35%A；6～ 8 min，35%A；8.0～ 8.5 min，35% → 95%A；8.5～10.0 min，95%A。

1.3.4 質譜條件

離子源：ESI和APCI復合源，正離子掃描；一級TOF-MS掃描質量范圍（m/z）：50～500 Da；二級IDA-MS掃描準確質量范圍（m/z）：50～500 Da。每10個樣品自動校正1次，正離子模式校正液流速為0.5 mL·min-1，氣簾氣（N2）：40 psi，離子源霧化氣（N2）：50 psi，離子源加熱輔助氣（N2）：50 psi，離子源溫度為650 ℃，離子源電壓為5 500 V。去簇電壓DP為80 V，碰撞能量為（30±15）eV；監測模式：TOF-IDA-MS。

1.3.5 數據分析處理

由于氯化琥珀膽堿的離子化模式為正離子，母離子為雙電荷[M-2Cl]2+，根據分子式C14H30Cl2N2O4，得到其母離子理論值為m/z145.110 28，通過TOF-MS和IDA-MS獲得化合物的母離子及子離子的精確質荷比，以各個碎片離子的精確質荷比和保留時間定性，一級母離子響應強度定量。母離子實測值為m/z145.109 85，誤差為0.79×10-6。另外，選擇2個主要子離子m/z115.574 51和m/z86.099 02?；衔锏乃槠畔⑹褂肁nalyst TF 1.6軟件采集，并采用PeakView 2.0，MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等軟件進行進一步的處理。氯化琥珀膽堿母離子提取離子流圖見圖1。

圖1 標準品提取離子流圖

1.4 前處理材料及參數的選擇和優化

分別使用不同的溶劑對目標物進行提取，每種溶劑重復6次提取，以測得的平均回收率為評判依據，選擇回收率最高的溶劑作為提取溶劑。同時對比HLB和WCX固相萃取柱，選擇回收率最高的進行凈化，最終探討不同體積的洗脫液對回收率的影響，結果使用Origin 8.5版本軟件繪圖。

1.5 基質效應的探討

通過使用基質空白液配制標準溶液進行測定，以響應值的降低或升高幅度為指標，判斷基質效應為正效應或負效應，且其影響是否顯著，進一步判定是否需要使用基質曲線進行定量。

1.6 方法學實驗

使用陰性樣品，通過信噪比的3倍和10倍，分別確定方法的檢出限和定量限，并且通過Excel軟件計算出相應的標準曲線方程和相關系數等參數，同時設計不同倍數的加標回收實驗，計算出回收率和相對標準偏差，綜合評判方法的實用性。

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

對比氨水（pH=9.0）、30%乙腈水和甲醇對樣品的提取效果，計算出對應的回收率。由圖2知，氯化琥珀膽堿水溶性較強，使用純甲醇作為提取劑時，回收率小于50%，使用氨水（pH=9.0）進行提取時，雖然是純水相提取，但由于蛋白質干擾導致溶液渾濁，影響進一步過柱凈化。當使用30%乙腈水進行提取時，因為乙腈能起到沉淀蛋白質的作用，因此凈化效果也較好，平均回收率在85%以上。

圖2 不同溶劑對回收率的影響圖

2.2 固相萃取柱的選擇

由于氯化琥珀膽堿在不同pH值的溶液中能以分子或者離子形式存在，因此理論上根據環境pH值的不同，可用不同的固相萃取柱進行凈化。實驗對比了HLB和WCX兩種固相萃取柱對氯化琥珀膽堿回收率，雖然HLB對分子態的氯化琥珀膽堿有一定的吸附作用，但在淋洗過程中，仍然會有較多的流失，最終HLB的平均回收率為77.2%，而WCX對離子態的氯化琥珀膽堿吸附較好，在凈化過程中，不易損失，平均回收率達到92.1%，因此最終選擇WCX固相萃取柱進行凈化。

2.3 洗脫溶液體積的優化

由于在堿性條件下，離子態的氯化琥珀膽堿和WCX固相萃取柱的填料結合較牢固，因此，即使使用高比例有機相的中性溶液，也難以洗脫。為了讓氯化琥珀膽堿能更好地洗脫，需要使用一定比例的酸性溶液，且有機相要較高。經初步研究，實驗使用甲酸乙腈水溶液（1/8/1，V/V/V）能有效將氯化琥珀膽堿進行洗脫。同時對使用體積進行探究，用量過少，有可能會導致洗脫不充分，回收率較低，用量過多，則會造成方法整體靈敏度下降，提高檢出限。最終結果顯示，當洗脫液用量為2 mL時，平均回收率能達到90%以上，詳見圖3。

圖3 洗脫液用量對回收率的影響圖

2.4 基質效應的探討

狗肉中含大量的肌肉纖維、蛋白質、脂肪以及較多的內源性化合物，基質較為復雜，因此有可能對測定過程造成影響。因此實驗分別使用空白基質溶液和純溶劑溶液配制了200 μg·L-1的單點標準溶液，以考察狗肉基質對氯化琥珀膽堿在儀器中的響應影響。結果表明，空白基質溶液配制的單點標準，響應值只有純溶劑溶液配制的10%左右，說明離子化抑制效應明顯，因此實驗最終使用基質曲線進行定量校正。

2.5 線性關系和靈敏度

使用空白基質溶液配制好基質曲線后，按優化后的儀器方法進行測定。在濃度范圍為1.0～100.0 μg·L-1的條件下，以濃度為橫坐標，所測得的峰面積為縱坐標，擬合曲線后，氯化琥珀膽堿的線性方程為Y=52.99X+1.71×102，相關系數r2為0.999 2，說明曲線具備準確的定量能力。另外，以儀器信噪比的3倍和10倍，分別測得方法檢出限為10 μg·kg-1，方法定量限為30 μg·kg-1。方法具備較好的靈敏度，可滿足分析測定的要求。

2.6 回收率與精密度實驗

進一步對方法的回收率和精密度進行探究，以氯化琥珀膽堿的方法定量限為基準進行不同濃度的加標回收實驗，分別對同一陰性樣品，進行1倍、2倍和10倍定量限濃度的添加，在同樣的條件下，重復6次平行實驗，具體結果見表1。3個不同水平中，平均回收率為86.3%～91.6%，相對標準偏差為2.99%～5.54%，方法的回收率和精密度都較好，適用于實驗室測定。

表1 加標回收結果及偏差表（n=6)

2.7 實際樣品的測定

在實驗中選取日常樣品15個，用本方法進行測定，結果顯示有2個樣品檢出氯化琥珀膽堿，含量分別為0.23 mg·kg-1和 1.14 mg·kg-1。其余樣品均未檢出。陰性樣品色譜圖和陽性樣品色譜圖見圖4。

圖4 實際測定樣品色譜圖

3 結論

本文使用30%乙腈水溶液對樣品中的氯化琥珀膽堿進行提取，調節pH值后使用WCX固相萃取柱進行凈化，回收率達85%以上，效果較好；優化色譜及質譜條件，使測定方法的靈敏度較高，而且目標物峰形對稱良好；結合高分辨飛行時間質譜，準確測定母離子及子離子的精確分子量，排除假陽性的可能；使用基質曲線進行定量，校正了基質效應對結果帶來的偏差；相關的方法學實驗證明，方法回收率和精密度高，能滿足日常的檢測要求。