水中胞嘧啶氯化消毒副產物生成試驗及毒性分析

張正斌，張詩圣，顏曉姝，林 濤,*

(1.江蘇長江水務股份有限公司，江蘇揚州 225009；2.河海大學環境學院，江蘇南京 210098)

近年來，天然水體和飲用水配水系統中出現的溶解性微生物產物(SMPs)已經引起了廣泛的關注[1-2]。SMPs由包括多糖、蛋白質、DNA、腐植酸等的大分子和細胞碎片組成。現階段對該類污染的研究主要集中于考察其遷移轉化機理并利用物化方法將其去除方面，然而將其作為消毒副產物前體物的研究仍有待擴充[3-4]。基于SMPs在飲用水處理工藝中去除的不徹底性，在后期的氯化消毒過程中會產生對人體有毒有害的含碳消毒副產物(C-DBPs)及含氮消毒副產物(N-DBPs)，進而影響飲用水安全性[5-7]。

細胞大分子可通過與水和環境的相互作用降解為小分子。嘧啶堿基和嘌呤堿基作為具有生物活性作用的非揮發性有機物(水中80%的有機物為非揮發性)，是DNA中重要的含氮組分，并已在原水和飲用水中被檢測到[8-9]。據研究調查[10-11]，嘧啶堿基氯化產生C-DBPs和N-DBPs的平均水平高于嘌呤堿基，且遺傳毒性也高于嘌呤堿基。此外，在2種嘧啶堿基(胞嘧啶和胸腺嘧啶)中，已有文獻報道，胞嘧啶由于產生三氯硝基甲烷、二氯乙腈和三氯乙腈等，N-DBPs的數量更大而更具毒性[10]。盡管氯化能夠高效降解胞嘧啶，但環境因素(如加氯量、pH和反應時間等)的作用對降解行為的影響尚不明確，且氯化降解胞嘧啶的毒理效應仍待評估。

本文采用氯化方式對DNA堿基中具有代表性的胞嘧啶進行氯化反應，考察了不同環境因素作用下氯代含碳及含氮消毒副產物的生成情況，衡量了多種消毒副產物造成的基因毒性和遺傳毒性，為水環境中SMPs污染導致的飲用水消毒副產物的生成及去除提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試劑：胞嘧啶(Cytosine，純度為99.0%)購自美國 Sigma-Aldrich 公司，其物化性質參數如表1所示；三氯甲烷(TCM)、鹵乙酸(HAAs)、鹵乙腈(HANs)、三氯硝基甲烷(TCNM)等消毒副產物標準物質購自德國Alfa-Aesar公司；甲基叔丁基醚(MTBE)為色譜純，購自美國 Sigma-Aldrich 公司；其他化學藥劑，如次氯酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、抗壞血酸、無水硫酸鈉等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；配制溶液的超純水采用Millipore超純水凈化系統(Millipore Milli-Q Gradient，Billerica，USA)制備。試驗瓶用超純水沖洗3次，然后在105 ℃的烘箱中干燥24 h。

表1 DNA堿基胞嘧啶的物化性質參數Tab.1 Selected Physicochemical Properties of DNA Base Cytosine

1.2 試驗方法

氯化反應在100 mL棕色安培瓶中進行，胞嘧啶的初始濃度為0.050 mmol/L。試驗采用10 mmol/L的磷酸二氫鉀溶液、0.1 mol/L的HCl及NaOH將溶液調節至所需 pH(未做特殊說明時，pH 值為7.0)，并按照試驗要求加入定量的NaClO溶液(使用前標定濃度，以Cl2計；未做特殊說明時，氯劑量為0.50 mmol/L)。將上述溶液裝滿100 mL棕色安培瓶，并使用帶有聚四氟乙烯墊片的蓋子旋緊并確保無氣泡，保證反應生成后的揮發性 DBPs 均存在于水相中，將水樣放置于黑暗環境下的培養箱內反應特定的時間(未做特殊說明時，反應時間為24 h)，溫度控制為(25.0±0.50) ℃。反應結束后，從瓶中取出10 mL放入25 mL安培瓶中，加入抗壞血酸消耗余氯，再加入2 mL的MTBE(檢測鹵代乙腈試驗中另加入10 g無水硫酸鈉)，擰緊瓶塞，將有機相與水相混合溶液在漩渦振蕩器上液液萃取振蕩5 min，靜置3 min分層，取上層有機相進入氣相色譜儀檢測消毒副產物生成情況。每組試驗均進行3次。

1.3 消毒副產物檢測方法

三氯甲烷(TCM)、鹵乙腈(HANs)、三氯硝基甲烷(TCNM)樣品分離方法采用甲基叔丁基醚(MTBE)為萃取劑進行液液萃取，并用配有對鹵族有機物靈敏度較高的電子捕獲檢測器(ECD)的氣相色譜儀(GC-7890B，Aglient，USA)檢測，氣相色譜分析參數條件如表2所示。鹵乙酸(HAAs)的測定采用EPA552標準方法，采用MTBE做萃取劑進行液液萃取，用酸化的甲醇做酯化劑將鹵乙酸進行衍生化以便于測定，并用GC-HP6890對酯化后的鹵乙酸進行分析，選用 1,2-二溴丙烷做內標進行定量。消毒副產物的產率計算[12-13]如式(1)。

(1)

表2 消毒副產物氣相色譜分析參數條件Tab.2 Analysis Parameters of GC for DBPs

1.4 毒性評估方法

采用式(2)和式(3)的毒性模型[14]評估胞嘧啶氯化產生消毒副產物的綜合毒性，并選擇碘乙酸(毒性最強的消毒副產物之一)作為TEFi計算的參考化合物[15]。消毒副產物對哺乳動物中國倉鼠卵巢細胞(CHO)的細胞毒性和遺傳毒性作用已在103種消毒副產物的體外試驗中進行了系統的研究[16]。細胞毒性的EC值對應72 h暴露的LC50(semi-lethal concentration，半致死濃度)，而遺傳毒性的EC值對應4 h暴露的50% Tail DNA值(單細胞凝膠電泳試驗中，尾部DNA含量為50%)[16]。

TEQ=∑[Ci]×TEFi

(2)

TEFi=ECref/ECi

(3)

其中：Ci——某種消毒副產物的生成濃度，mmol/L；

TEFi——該消毒副產物相應的毒性當量因子；

TEQ——綜合毒性當量濃度，mmol/L；

ECref——碘乙酸的有效毒性濃度，mol/L；

ECi——某種消毒副產物的有效毒性濃度，mol/L。

2 結果與討論

2.1 加氯劑量對消毒副產物生成的影響

為考察消毒過程中消毒劑劑量對胞嘧啶氯化消毒副產物生成的影響，研究在不同加氯劑量下，胞嘧啶相應消毒副產物的產率變化情況。向含有0.050 mmol/L底物的溶液中分別加入0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mmol/L的自由氯，控制pH值=7.0，在黑暗(25.0±0.50)℃ 條件下反應24 h后進行測定分析，結果如圖1所示。

圖1 不同加氯劑量對胞嘧啶氯化過程中消毒副產物生成的影響 (a)消毒副產物濃度；(b)消毒副產物產率Fig.1 Effects of Different Chlorine Dosages on the Formation of DBPs during the Chlorination of Cytosine (a) Concentrations of DBPs; (b) Yields of DBPs

由圖1可知，隨著氯投加量的增加，除鹵乙腈外的4種消毒副產物的產率均呈現上升趨勢。當氯劑量/底物濃度的摩爾比為20時，三氯甲烷的產率(0.101%±0.004 0%)約為氯劑量/底物濃度摩爾比為1時產率(0.017%±0.002 0%)的6倍，再次證明了三氯甲烷在氯存在條件下具有較強的穩定性，且作為氯化終端產物之一的三氯甲烷產率隨著加氯量的增加而增加[17-20]。二氯乙酸的產率總體上僅次于三氯甲烷，但當氯投加量達到0.50 mmol/L時，二氯乙酸的產率高于三氯甲烷的產率，這表明當氯劑量/胞嘧啶濃度的摩爾比從5增加至10時，二氯乙酸產率的升高速率大于三氯甲烷。

氯化胞嘧啶生成的含氮消毒副產物鹵乙腈的產率隨著加氯劑量的提高，表現出先升高后下降的趨勢。當氯投加量為0.50 mmol/L時，二氯乙腈和三氯乙腈的產率分別有最大值0.049%±0.003 5%和0.024%± 0.002 0%。由于三氯乙腈是二氯乙腈的氯化生成物，其生成濃度低于二氯乙腈。二氯乙腈和三氯乙腈均具有不穩定性及自分解特性[21-23]，其生成濃度既取決于形成速率也取決于分解速率，且試驗發現，不同氯濃度下鹵乙腈生成和降解速率的貢獻是不同的。據先前的研究報道，與低氯濃度水平相比，較高的氯投加量能夠促進二氯乙腈和三氯乙腈在水中的降解[24-25]。當加氯劑量逐漸飽和甚至過量后，這種影響更加明顯。但應當注意，在不同加氯劑量條件下，二氯乙腈是氯化胞嘧啶產生的含氮消毒副產物中突出的組分。

2.2 氯化時間對消毒副產物生成的影響

為考察消毒過程中反應時間對胞嘧啶氯化消毒副產物生成的影響，研究在不同氯化時間下，胞嘧啶相應消毒副產物的產率變化情況。向含有0.050 mmol/L底物的溶液中加入0.50 mmol/L的自由氯，控制pH 值=7.0，在黑暗(25.0±0.50)℃條件下分別反應1、6、12、24、48 h后進行測定分析，結果如圖2所示。

圖2 不同氯化時間對胞嘧啶氯化過程中消毒副產物生成的影響 (a)消毒副產物濃度；(b)消毒副產物產率Fig.2 Effects of Different Contact Time on the Formation of DBPs during the Chlorination of Cytosine (a) Concentrations of DBPs; (b) Yields of DBPs

由圖2可知，隨著氯化反應時間從1 h延長至48 h，三氯甲烷的生成表現出持續增長的趨勢，產率從0.018 2%±0.002 0%升高至0.099 4%±0.005 0%，且1～6 h的產率增幅(0.020 5%)遠大于6～12 h的產率增幅(0.008 9%)。先前的研究發現，三氯甲烷的生成速率在與氯的短時間接觸內較快，然后逐漸減緩[26-28]。除三氯甲烷外，其他消毒副產物的產率均呈現先升高后降低的趨勢。二氯乙酸濃度在1～24 h大于三氯甲烷，表明二氯乙酸是胞嘧啶氯化反應初期生成能力最強的消毒副產物。二氯乙酸、三氯乙酸、三氯硝基甲烷在氯化反應進行至12 h時分別有最大產率0.068 1%±0.004 0%、0.037%±0.002 0%、0.021%±0.002 5%，且48 h時溶液中已經無法檢測到三氯硝基甲烷的存在。據已有文獻報道，三氯硝基甲烷在氯化作用的過程中存在被逐漸消耗或轉化生成其他消毒副產物的現象[29-31]，從而導致其產率隨氯化時間延長呈現先增加后降低的趨勢。而二氯乙腈和三氯乙腈的最高產率出現在24 h，分別為對應0.049%±0.003 5%和0.024%±0.002 0%。

在次氯酸的氧化下，胞嘧啶分子結構發生了脫氮反應，并隨著時間的延長，脫氮程度加劇，而含氮消毒副產物的毒性要遠大于常規含碳消毒副產物的毒性，在極低的濃度下即能夠產生嚴重的毒理效應[32-33]。三氯乙腈和三氯硝基甲烷二者的產率總體上處于較低水平，且氯投加量在反應的初始階段即存在過量的問題，表明在胞嘧啶的氯化過程中，這2種含氮消毒副產物的生成能力較弱。值得注意的是，二氯乙腈可被認為是胞嘧啶氯化反應中關鍵的含氮消毒副產物，這與之前一些前體物氯化消毒的研究結論相似[34-36]。

2.3 pH對消毒副產物生成的影響

為考察消毒過程中pH對胞嘧啶氯化消毒副產物生成的影響，研究在不同pH下，胞嘧啶相應消毒副產物的產率變化情況。向含有0.050 mmol/L底物的溶液中加入0.50 mol/L的自由氯，將反應溶液的pH值分別調節至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在黑暗(25.0±0.50)℃ 條件下分別反應24 h后進行測定分析，結果如圖3所示。

圖3 不同pH對胞嘧啶氯化過程中消毒副產物生成的影響 (a)消毒副產物濃度；(b)消毒副產物產率Fig.3 Effects of Different pH Value on the Formation of DBPs during the Chlorination of Cytosine(a) Concentrations of DBPs; (b) Yields of DBPs

由圖3可知，隨著pH值從5.0升高至9.0，三氯甲烷產率呈現穩定增長的趨勢，產率增幅為0.095 3%，其他消毒副產物的產率均先增加后降低。當pH值=5.0～7.0時，二氯乙酸的生成能力要高于三氯甲烷，且pH值=6.0時的差距最明顯，該條件下二氯乙酸產率約為三氯甲烷產率的2.5倍。鹵乙酸和鹵乙腈均在pH值=6.0時有最大產率，表明在偏酸性條件下更有利于其生成。而三氯硝基甲烷的生成濃度波動不是特別顯著，最大產率出現在pH值=7.0時，說明酸性或堿性條件會抑制三氯硝基甲烷的存在。當pH值=9.0時，溶液中未能檢測出三氯乙腈的存在，且此時三氯乙酸、二氯乙腈和三氯硝基甲烷的濃度也處于較低水平。

溶液的pH通常是影響消毒副產物形成和降解的重要因素。Xu等[37]研究發現，環狀有機物在堿性條件下能夠發生開環反應，然后與游離氯反應進而生成三氯甲烷。當pH較高時，鹵乙腈由于不穩定會發生堿-自降解作用或堿-催化水解作用，從而生成更加穩定的消毒副產物，如三氯甲烷[19]。因此，三氯甲烷隨 pH 升高而產率增加屬于多因素的綜合作用。此外，二氯乙腈的水解速率常數隨pH的增大而增大[24]，符合pH值>6.0時二氯乙腈產率的下降速率隨 pH 上升而增大的現象。同樣亦能發現，在不同pH作用下，二氯乙腈是胞嘧啶氯化反應中關鍵的含氮消毒副產物。

2.4 氯化反應毒性評估

6種消毒副產物的毒性當量因子計算結果如表3所示。其中，二氯乙腈的細胞毒性當量因子最大，而3種含氮消毒副產物的遺傳毒性當量因子遵循三氯硝基甲烷>三氯乙腈>二氯乙腈。圖4(a)～圖4(c)顯示了通過加和毒性模型評估不同反應條件下(加氯劑量、氯化時間、pH)胞嘧啶氯化消毒副產物的細胞毒性和遺傳毒性的結果。

由圖4(a)可知，隨著氯投加量的增加，細胞毒性表現出先增加后降低的趨勢，最大值出現在加氯劑量/胞嘧啶濃度的摩爾比為10時，而遺傳毒性持續增長，且氯投加量的飽和或過量使遺傳毒性的增長逐漸減緩。氯化反應時間對毒性的影響如圖4(b)所示。當反應時間從1 h延長至48 h時，細胞毒性和遺傳毒性均呈現先增加后降低的變化趨勢，且毒性最高值分別出現在24 h和12 h。值得注意的是，細胞毒性和遺傳毒性的當量濃度水平在12 h時非常接近，但當氯化反應進行到48 h時，細胞毒性的當量濃度水平約為遺傳毒性的11.5倍，亦即存在一個數量級的差異，表明氯化消毒時間能夠對遺傳毒性的波動產生重要影響。由圖4(c)可知，隨著反應溶液pH值由5.0升高至9.0，2種毒性的波動亦遵循先增加后降低的規律，且細胞毒性在pH值=6.0時有最大值，遺傳毒性的最大值存在于pH值=7.0時，而pH值=9.0時同時存在最小的細胞毒性和遺傳毒性當量濃度，表明偏堿性條件能有效降低胞嘧啶氯化消毒產生的細胞毒性和遺傳毒性。

綜合2.1～2.3節中不同反應條件下胞嘧啶氯化消毒副產物產率變化規律的研究結果，可以發現：增大加氯劑量可明顯促進含碳消毒副產物的生成，但加氯量對毒性變化的影響受含氮消毒副產物產率的主導；隨著氯化時間的延長，除三氯甲烷外的消毒副產物產率均呈先升高后降低的趨勢，而毒性變化也呈現類似趨勢；相比于加氯劑量和反應時間，pH的變化能同時對消毒副產物生成和毒性作用產生顯著的直接影響。值得注意的是，雖然含氮消毒副產物的生成量小于含碳消毒副產物，但由于其具有更高毒性而能夠主導整體的毒性當量濃度的變化。除此之外，鹵乙腈的產率對細胞毒性的貢獻最大，而影響遺傳毒性的最關鍵因素是三氯硝基甲烷的產率。

圖4 不同反應條件下胞嘧啶氯化產物的細胞毒性和遺傳毒性 (a)加氯劑量；(b)氯化時間；(c) pH值Fig.4 Cytotoxicity and Genotoxicity of Cytosine′s Chlorinated Products under Different Reaction Conditions(a) Chlorine Dosages; (b) Reaction Time; (c) pH Value

表3 消毒副產物毒性當量因子Tab.3 Toxic Equivalency Factor of DBPs

3 結論

本研究考察了不同反應條件下胞嘧啶氯化產生的消毒副產物及其毒性情況。胞嘧啶氯化消毒能夠生成三氯甲烷、鹵乙酸、鹵乙腈、三氯硝基甲烷等多種氯代含碳及含氮消毒副產物。二氯乙酸是胞嘧啶氯化初期生成能力最強的消毒副產物，而二氯乙腈可被認為是反應中關鍵的含氮消毒副產物。提高氯投加量可促進二氯乙腈和三氯乙腈在水中的降解，進而降低產率。隨著加氯劑量的增加，細胞毒性先增加后降低，而遺傳毒性穩定增長。隨著氯化反應時間的延長，除三氯甲烷外的消毒副產物產率均表現出先升高后下降的趨勢，且總體的細胞毒性和遺傳毒性也遵循先增加后降低的變化。三氯甲烷的產率隨 pH 的升高而增加，偏酸性條件能夠促進鹵乙酸和鹵乙腈的產率，而中性條件有利于三氯硝基甲烷的生成。胞嘧啶氯化消毒產生的細胞毒性和遺傳毒性能同時在偏堿性條件下被抑制。細胞毒性被鹵乙腈的產率所主導，而影響遺傳毒性的最關鍵因素是三氯硝基甲烷的產率。通過不同環境因素作用下胞嘧啶的氯化，探究DBPs的產生規律，評估綜合毒性，為控制飲用水處理和輸配過程中由于SMPs污染導致的DBPs的生成提供理論支撐，降低其對飲用水衛生安全性的威脅。